巨噬细胞在自体脂肪移植中作用机制的研究进展

    近年来，自体脂肪移植已成为整形外科最常用的治疗手段之一，但脂肪移植物存活率的无法预测性仍然是影响其发展的主要因素。越来越多的证据显示，炎症反应与脂肪移植物的存活和再生密切相关[1,2]。移植后的脂肪暴露在急性缺氧环境中，可观察到移植物中有较高水平的巨噬细胞和中性粒细胞浸润[3]。其中，巨噬细胞作为与组织再生关系最为密切的细胞之一，随着研究的深入，其在脂肪移植中的作用日渐突显。本文以巨噬细胞为中心，对其来源、分型及在脂肪移植中的作用和相关机制进行综述，旨在为完善移植脂肪成活理论及提高脂肪移植物的成活提供新的思路。

    一、巨噬细胞的来源、激活及分型

    (一)巨噬细胞的来源

    巨噬细胞广泛分布于全身组织中，主要来源于卵黄囊和骨髓[4,5]。一方面，卵黄囊来源的髓系偏向祖细胞和原始造血巨噬细胞在胚胎时期可迁移到胎儿肝脏，分化为单核细胞，然后迁移到不同的发育组织中，在出生前开始分化为组织常驻巨噬细胞(tissue-resident macrophages, TRMs)[6]；另一方面，当组织稳态发生变化时，骨髓可向受损组织输送单核细胞，在炎症因子的作用下单核细胞分化为巨噬细胞[7]。

    (二)巨噬细胞的激活及分型

    巨噬细胞是一个具有高度异质性的细胞群，目前主要根据巨噬细胞对不同刺激物产生反应后表达的标志物将其分为经典激活型(M1表型)和替代激活型(M2表型)[8]。目前被确认的M1型激活物有干扰素γ、Toll样受体配体[如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)]和细胞因子(如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)；M2型激活物则有白介素(interleukin，IL)-4、IL-13、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)等[9,10]。巨噬细胞在不同的激活物刺激下会产生不同的表型，在免疫反应中的作用也截然不同。M1型具有较强的吞噬能力，且可以产生多种促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α )、IL-6等。相反，M2型表达高水平的免疫抑制因子IL-10和低水平的促炎因子IL-12，抑制炎症并促进损伤愈合，在创伤修复中发挥关键作用[11,12]。值得强调的是，巨噬细胞的极化具有动态性，可能以M1、M2混合表型存在，而不是截然不同的巨噬细胞群体，其混合的表型往往取决于激活和抑制物的活性及组织微环境的平衡[13]。

    二、巨噬细胞在自体脂肪移植中的作用及其机制

    (一)脂肪组织中的巨噬细胞

    在正常脂肪组织中，TRMs约占细胞总数的10%[14]，其在脂肪组织中发挥着重要作用，如吞噬病原体、清除坏死和凋亡的细胞、铁的代谢储存和脂肪生成的调节等，以维持脂肪组织的稳态和正常功能[15]。而在肥胖个体中，脂肪细胞功能发生紊乱并分泌大量促炎因子，促进巨噬细胞的募集和活化，巨噬细胞的比例可高达细胞总数的50%[16]。

在移植后的脂肪中，TRMs和募集来的巨噬细胞共同发挥作用，不仅通过吞噬作用清除坏死细胞，而且控制血管生成、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)重塑等过程[17,18,19]。在损伤引发的急性炎症和随后的再生过程中，巨噬细胞对于组织的修复和恢复其微环境的稳态是必不可少的。

    (二)巨噬细胞介导的炎症过程

    1．脂肪移植后巨噬细胞的募集

    一方面，脂肪移植后早期移植物暴露在缺血缺氧的环境下，导致缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor, HIF)信号和鞘氨醇激酶(sphingosine kinase, SphK)的激活。HIF-1α的过度表达可通过促进趋化因子CC配体2/单核细胞趋化蛋白-1分泌及对下游效应子细胞外信号调节激酶、蛋白激酶B和p38的调控，促使单核细胞和巨噬细胞向受区迁移[20,21]，而SphK可通过鞘氨醇1磷酸/鞘氨醇1磷酸受体信号通路募集骨髓来源的单核细胞[22]。另一方面，移植物内的死亡细胞释放的Toll样受体、黏附分子和损伤相关分子模式也会触发复杂的炎症反应，引起巨噬细胞的募集[23]。

    2．巨噬细胞形成"花冠样结构"

    移植脂肪中坏死、凋亡的脂肪细胞周围可观察到大量巨噬细胞形成的"花冠样结构(crown-like structure，CLS)"[2]。CLS是一种死亡的脂肪细胞和巨噬细胞产生的独特结构，且与脂肪细胞的大小有关[24]。定位于CLS巨噬细胞上的巨噬细胞诱导C型凝集素(macrophage-inducible C-type lectin, Mincle)可以感知脂肪细胞死亡，并诱导促炎细胞因子的产生[25]。Tanaka等[26]证实，CLS的数量与脂肪组织的炎症水平和纤维化存在正相关关系，Mincle在CLS的形成和脂肪组织纤维化中发挥了关键作用。这提示，巨噬细胞可以作为靶点调控炎症过程的进展，促进或逆转移植物的纤维化。

    3．脂肪移植后巨噬细胞的表型转换

    有学者指出，脂肪移植物内的炎症细胞和炎症因子随时间呈明显的动态变化趋势[27]。通过对炎症细胞的定量分析发现，在脂肪移植后1周巨噬细胞成为移植物中主要的炎症细胞类型，移植物内大多数的巨噬细胞为M1极化状态(CD11b+、F4/80+、CD206low、CD11chigh)。M1型巨噬细胞可分泌大量TNF-α，并在移植后的第1天达到高峰，随后逐渐下降。动物实验证实，脂肪组织是TNF-α作用的主要靶点，其具有抑制脂肪生成、促进脂解、增加游离脂肪酸释放等作用[28]。脂肪移植后的第2~4周，M2型巨噬细胞(CD11b+、F4/80+、CD206high、CD11clow)的数量逐渐占据优势，且转化生长因子-β表达水平较高。由此可见，不同极化状态的巨噬细胞对移植物的作用不同，极化状态的转变同时也介导移植物由"炎症状态"进入"再生状态"[27,29]。

    (三)巨噬细胞介导的组织再生

    1．巨噬细胞对脂肪移植物血管化的作用

    血管化是组织再生的关键环节。目前，M2型巨噬细胞已被证实在早期新生血管形成过程中起关键作用，其促血管生成的作用可能是通过释放促血管生成的细胞因子，如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和血管内皮生长因子等，其为内皮细胞出芽和形成血管网络所必需[30,31,32]。而血管新生和脂肪移植物体积保留率之间的密切关联，早已被多名学者所证实[33,34,35]。Phipps等[1]的研究首次证明，在脂肪移植物中添加M2型巨噬细胞，可通过刺激血管生成提高自体脂肪移植物体积的保留率。其中，M2型巨噬细胞是通过M-CSF和IL-6诱导未分化的巨噬细胞而获得。Cai等[27]的研究结果表明，在巨噬细胞缺乏的小鼠中未观察到血管向脂肪移植物生长，且脂肪移植物的长期存活率明显降低；而在脂肪移植术后早期激活巨噬细胞并促进其向M2型极化可明显提高移植物的存活率，这与Phipps等[1]的研究结果相一致。此外，巨噬细胞还可通过产生基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)，在脂肪移植的早期起到募集血源性干细胞的作用。SDF-1主要来源于巨噬细胞，在许多损伤的组织中均呈高表达状态，并可以通过SDF-1/趋化因子受体-4轴作用于间充质干细胞，使其迁移到损伤部位，以完成对组织的修复和再生[36]。

    2．巨噬细胞对前体脂肪细胞的作用

    目前很多研究表明，巨噬细胞对前体脂肪细胞有明显影响，继而可能影响脂肪组织的再生。前体脂肪细胞是一类可增殖并定向分化为成熟脂肪细胞的细胞群，在脂肪移植物的体积保留率方面具有重要作用。Liu等[37]将人皮下的前体脂肪细胞与巨噬细胞共培养后发现，巨噬细胞对人皮下前体脂肪细胞的成脂分化能力具有明显的抑制作用。但不同极化状态的巨噬细胞作用并不一致。而后，有学者对脂肪移植物内的M1型和M2型巨噬细胞分别进行了选择性的清除，发现这种对成脂能力的抑制作用主要由M1型巨噬细胞介导而非M2型[38]。此外，不同极化状态的巨噬细胞对前体脂肪细胞凋亡的影响也不同。Molgat等[39]利用LPS和IL-4对巨噬细胞进行预处理，使其产生不同的极化状态，并制备巨噬细胞条件培养基(macrophage-conditioned medium, MacCM)。结果显示，来自IL-4处理的MacCM可通过血小板衍生生长因子阻止前体脂肪细胞凋亡，而经LPS处理的MacCM则对前体脂肪细胞的存活产生负面作用。由此推断，M2型巨噬细胞对前体脂肪细胞凋亡具有保护作用，M1型则截然相反。关于巨噬细胞对前体脂肪细胞增殖能力的作用，现有的研究结果尚未得出统一的结论。Lacasa等[40]将LPS刺激过的巨噬细胞与前体脂肪细胞共培养后发现，前体脂肪细胞的增殖速度加快。之后又有学者将巨噬细胞与前体脂肪细胞共培养，并未发现其与前体脂肪细胞增殖速度之间有关系[37]。相信随着人们对巨噬细胞的表型谱的理解日益加深，这些结论存在相互矛盾的问题会得到解决。

    3．巨噬细胞参与ECM的重塑

    关于脂肪组织的再生潜力，国内外大多数学者的研究通常集中于脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells，ASCs)在其中的作用。但脂肪移植物由游离的小颗粒修复为完整的脂肪组织，需要经历一个重要且容易被忽视的再生过程，即ECM的重塑，它提供了组织结构支持及关键的生化信号。已有学者证实，巨噬细胞早期可以通过调节移植物ECM的重构来影响脂肪移植物的存活率[41]。但这种调控具有双向性，巨噬细胞通过分泌细胞因子显著刺激前体脂肪细胞合成多种ECM蛋白，同时M2型巨噬细胞可以产生MMPs分解胶原纤维、降解ECM[42,43]。如果炎症或损伤持续存在，巨噬细胞在移植环境中维持较长时间(4周以上)，则并不会继续发挥对移植物体积保留率的积极影响，相反会引起Ⅵ型胶原的表达上调，导致移植物纤维化[2,3,27]。有研究表明，巨噬细胞在体内可以杂交表型存在，这种混合表型(M1/M2型)巨噬细胞与M2型巨噬细胞相比，可以促进更多的天然ECM产生，并且减少纤维化[44,45]，这为巨噬细胞的研究提供了新的方向。同时，这再次提示我们，巨噬细胞群具有高度异质的特性，如果将其作为一个整体看待，可能会导致实验结果解释的不确切。

    (四)供区巨噬细胞水平对受区的影响

    在临床实际的脂肪移植过程中，不仅受区会发生炎症反应，供区的损伤同样会立即引发强烈的炎症信号，募集巨噬细胞启动炎症反应。然而，在同一时间段内人体只能募集一定数量的巨噬细胞[46,47]。这意味着，受区的修复可能与供区存在竞争。有研究者采用小鼠模型模拟脂肪移植过程，一组仅接受脂肪移植而未行脂肪抽吸(单纯移植组)，另一组在进行脂肪抽吸的同时接受脂肪移植(Pro-移植组)。在脂肪移植后7 d内，单纯移植组有巨噬细胞浸润受区，其修复过程基本在30 d内完成；而Pro-移植组几乎没有巨噬细胞渗入受区，整个修复重塑过程比单纯移植组长30 d，移植物的体积保留率也较单纯移植组低[48]。由此推断，过大的吸脂面积带来的损伤可能会影响受区移植物的体积保留率。

    除上述之外，Chazenbalk等[49]提出了一种更具挑战性的可能，在将巨噬细胞和ASCs共培养后发现，巨噬细胞有向前体脂肪细胞分化的趋势。显然，巨噬细胞并不仅仅通过吞噬和分泌细胞因子发挥功能，作为炎症微环境中的重要角色，其在脂肪移植中的作用尚有许多未知的问题值得探索。

    三、脂肪纯化方式与巨噬细胞的关系

    虽然自体脂肪移植技术日渐成熟，但是如何获得更好的术后效果仍是亟待解决的问题。因此，细胞辅助的脂肪移植、生长因子及其类似物辅助脂肪移植等治疗方法应运而生[50,51]。但是，上述方法程序往往较为复杂，所以如何通过优化脂肪纯化处理流程来提高移植物的存活，仍是当前广大临床医生的研究热点。吸出的脂肪组织中混有的血液、肿胀液、油滴、细胞碎片和细胞因子，可引起炎症并影响移植效果[52]。一方面，移植脂肪中的全血会减少移植脂肪的体积保留率，这可能与全血引起长期高水平的M1型巨噬细胞有关[53]。另一方面，死亡的脂肪细胞和释放的油滴会被巨噬细胞吞噬，导致巨噬细胞源性泡沫细胞的形成和坏死，进而引发过度的炎症和纤维化[54]。由此，笔者推测，不同的纯化处理方式造成的脂肪组织活性和成分的差异，会导致巨噬细胞的极化方向、浸润水平及持续时间发生改变，进而影响脂肪移植物的存活质量。目前，尚鲜见关于不同方法处理颗粒脂肪对巨噬细胞行为模式的跟踪描述及对比研究。如何通过优化脂肪处理方法使巨噬细胞尽可能发挥其有利的作用，值得学者们进一步探索。

    四、总结与展望(表1)

    巨噬细胞是介导组织炎症、再生和纤维化的关键成分，通过表型的转化完成了移植物由炎症反应进入再生状态的衔接，在脂肪移植术后的每个过程中均发挥重要作用。目前的研究表明，上调M2型巨噬细胞对脂肪移植物的体积保留率有积极作用。但是，在脂肪移植领域有关巨噬细胞的研究[1,3,27,41,48,55]仍然较少(表1)，尚需进一步实验明确调控巨噬细胞方法的安全性和可行性。若能明确移植脂肪中的巨噬细胞不同表型的动态变化过程、具体作用及调控机制，无疑会为脂肪移植领域带来新的思路和有力的理论基础，从而有效指导临床并规范脂肪处理操作。相信随着研究的逐渐深入，巨噬细胞疗法可能成为改善自体脂肪移植远期效果的一种新方法。

    利益冲突本文作者与论文刊登的内容无利益关系

参考文献

......

第十期内容

重视穿支皮瓣设计进一步提升我国创面修复水平

点击链接

巨噬细胞在组织再生中的调控作用

间充质干细胞诱导巨噬细胞极化促进创面愈合的研究进展

炎症微环境中巨噬细胞对前体脂肪细胞作用的研究进展