脱细胞真皮基质微粒与脂肪来源干细胞联合应用的进展

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本文来源：中国美容整形外科杂志 2022 年 2 月第 33 卷第 2 期

DOI：10.3969/j.issn.1673-7040.2022.02.019

作者：叶明敏 刘毅

作者单位：兰州大学第二医院 烧伤整形与创面修复外科， 甘肃 兰州 730000 

通信作者：刘毅，

Email: liuyi196402@163.com

脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix, ADM）是由异种或异体皮肤经过脱细胞而制成的组织薄片,主要含Ⅰ型胶原蛋白、弹性蛋白、层黏连蛋白、糖胺聚糖和一系列生长因子，其非细胞结构使其免疫原性大大降低[1]。EL Heck 等（1985 年）开发 了一种异体真皮与自体表皮相结合的复合移植方法，应用于大鼠创面模型的研究，并用于 6 例烧伤患者创面瘢痕的修复，取得了较好的修复效果，且有抑制创面后期瘢痕增生的效果。同种异体皮移植所引起的免疫排异反应主要来源于真皮中的内皮细胞（endothelial, ECs）、成纤维细胞（fibroblast, FB）等，所以学者们开始致力于研究真皮的去细胞化。

去除具有较强免疫原性的细胞成分后，ADM 作为多种胶原蛋白与弹性蛋白的复合物几乎不会再引起宿主的排异反应,且利于 FB、ECs 的生长和血管再生，可以在宿主体内长期存留并最终被降解以及引导正常组织重建[2]。ADM 去除了细胞成分，但保留了真皮乳头层表面的基底膜,从而保持了真皮细胞外基质（extracellular mafrix, ECM）和基底膜复合体的结构和生化完整性[3]。组织学分析显示,角质形成细胞优先附着于移植基质的基底膜复合物 （basement membrane complex, BCM）上，生长在覆盖的网状自体移植物真皮下（D Wainwright， 1996 年），基底膜可促进表皮细胞扩展，且能提供良好的支架作用，促进胶原结构和功能的重建，以及促进成纤维细胞增殖，诱导新生血管和上皮形成。基底膜面支持移植于其表面的断层皮片的生长，对表皮细胞的分化成熟和自体移植皮片的外观与功能起着非常重要的作用。真皮面为 FB 的生长提供了良好的支架，有利于 FB 的黏附生长。在支架内,FB 是主要细胞，其负责 ECM 蛋白的合成和重塑[4]，FB 合成以胶原纤维为主的 ECM 和多种细胞因子改善与重建真皮成分，以增加支架活性。FB 分泌的细胞因子还能够增强 ADM 诱导创周血管内皮细胞向内移行的能力，加速其血管化进程，而 ADM 内的毛细血管为 FB 的运动提供了动力，可促进原有胶原的吸收,并且转运胶原降解后的组织废物，有助于对脱细胞真皮胶原成分的改建，促使 FB 形成形态结构及排列分布正常的胶原纤维。最后，FB 逐渐长入 ADM 微粒间，使 ADM 逐渐被宿主组织取代，与周围组织界限不明显，最终与受体组织完全一体化。

2.1 ADM 的制备 去细胞的目的是有效去除组织中的所有细胞成分，而保留其结构与功能的完整性，尽量减少对机体的不利影响[5]。最早研制 ADM 的动力来源于在深度烧伤患者 中，自体真皮组织不能满足移植需要而采用同种异体供体皮 肤作为永久性皮肤移植受到其免疫原性和烧伤患者免疫抑制不当的限制，此时需要一种脱细胞、结构完整的真皮基质， 于是学者们开始致力于研制真皮基质的无细胞化。

1995 年，SA Livesey 等将猪的全厚皮在含青霉素和链霉 素的培养基中冷冻过夜后去除其表皮，将真皮在 0.5%十二 烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）中孵育 1 h，直至电镜下无法识别细胞器，从而去除真皮成纤维细胞和内皮细胞，首先成功制备出 ADM。ADM 制备方法缺少统一标准，目前主要有 DispaseⅡ-Triton 法、高渗盐水 -SDS 法、反复冻融法配合超声波震荡法以及 NaOH 消蚀法等[6]。(1)DispaseⅡ- Triton 法（Y Takami 等，1996 年）。将皮肤组织置于 2.5 U/ml 的 DispaseⅡ溶液中保存 48 h 后浸于 0.5% Triton 溶液中24 h, 用此方法制备出的 ADM 细胞成分少，但对基底膜的破坏较大，真皮移植后发生再上皮化较困难。(2)高渗盐水—SDS 法[7]。

将皮肤组织置于 1 mol/L 的 NaCl 溶液中保存 24 h 后，于室温下浸于 0.5%的 SDS 溶液中震荡 1 h。此法制备的 ADM 细胞清除率较高，基底膜也比较完整，但Ⅳ型胶原、HLA-DR 含量较高，因此移植后发生免疫排斥反应的可能性较大。(3)反复冻融法配合超声震荡法[8]。将皮肤组织置于液氮中反复冻融3 次，5 min/ 次，再浸于 3%NaCl 中 30 min 后置于超声振荡仪中洗脱 72 h，此法制备的 ADM 保留了完整的真皮基质,同时细胞成分含量也很低。为了进一步提高 ADM 的性能，目前在上述制备方法的基础上增加了一定的辅助技术，如与戊二醛交联剂联合使用 NaOH 预处理等。近年来，一些新技术的出现在不断改良 ADM 的制备，如将氧化壳聚糖双季铵盐与脱细胞真皮基质交联制得壳聚糖季铵盐型 ADM 材料，壳聚糖双季铵盐拥有更多的季铵基团，可以赋予 ADM 材料优良的抗菌性能[9]。

2.2 mADM 的制备 mADM 是在不同方法制备出的 ADM 基础上，通过切割或研磨等物理方法制备而成。汪海轮等[10]将 改良消蚀法制得的 ADM 经冷冻干燥后，使用物理方法切割 成约 0.3 mm×0.3 mm×0.3 mm 大小的立方体，用 PVC 袋分装，再经 ⁶⁰Co 照射灭菌后保存，并通过细胞毒性实验和皮下埋藏实验检验其相容性。结果表明，用该方法制备的 ADM 微粒基本无毒性，细胞清除率较高,相容性较好，胶原结构完整，FB 在 ADM 微粒上增殖良好。目前产品化 mADM 的常用粒径有≤0.5 mm、0.5 mm＜粒径≤1.0 mm、1.0 mm＜粒径≤ 2.0 mm 3 种规格[11]。