神经轴突再生与神经冲动的恢复

    周围神经损伤(peripheral nerve injury，PNI)是临床常见病，严重影响着患者的生存质量。手术干预是治疗严重神经损伤的金标准[1]，旨在连接神经残端的外膜，使轴突和施万细胞(Schwann cells，SCs)通过固有的生物学再生能力对损伤作出反应。但由于周围神经分化程度较高，轴突再生以及神经兴奋性的恢复常受到再生微环境、免疫反应及瘢痕因素的限制，单一手术治疗神经修复效果欠理想，尤其是面神经损伤所致的面瘫，患者常承受异常面容所带来的心理打击，因此周围神经再生一直是神经外科及整形外科领域研究的重点及难点。近年来随着基础研究的不断深入，越来越多的学者开始重视PNI轴突再生的分子细胞学水平的变化，以期最终改善神经修复的效果。本文综述了PNI后轴突再生及神经冲动恢复的分子细胞学机制，以及抑制神经再生的主要因素。

    一、神经轴突再生

    神经损伤后远端轴突将发生一系列复杂的生物学变化称为Wallerian溃变，其形态学表现为轴突细胞骨架溶解、轴膜降解、轴突髓鞘崩解、炎性细胞浸润并吞噬轴突碎片。Wallerain溃变中，SCs的功能将发生巨大变化，从参与髓鞘形成的细胞转变为轴突再生最重要的支持细胞。通过与轴突间形成紧密连接和缝隙连接进行信息传递及物质交换，可实现诱导、刺激轴突再生及髓鞘形成。因此Wallerain溃变不单是因轴浆运输中断、营养代谢障碍而发生的退行性改变，更是细胞损伤后积极的自我调节过程，为轴突再生营造适宜的微环境。

    (一)轴突再生通道的清理与建立

    PNI形成的轴突和髓鞘碎片若不及时清理会形成胶质瘢痕，将严重阻碍轴突再生。在Wallerain溃变中，轴突和髓鞘碎片的清理可以分为2个阶段：在Wallerain溃变早期，SCs自噬是PNI后髓鞘清理过程的重要机制，使髓鞘解离为卵圆形的胞内碎片，自噬小体吞噬这些髓鞘碎片，并将其送到溶酶体内分解[2,3]。随后血源性巨噬细胞在髓鞘碎片和单核细胞趋化蛋白1等趋化因子的作用下，由受损的血管-神经屏障大量涌入，并激活损伤轴突周围的巨噬细胞，以吞噬轴突和髓鞘碎片[4]。

    (二)触发再生反应的分子机制

    周围神经具有较强的再生潜能，轴突损伤后再生反应调节的首要和关键步骤是通过电压门控钙通道由细胞外间隙内流引起的Ca2+振荡[5]。神经损伤诱导的Ca2+动力学操控着损伤部位的局部事件，如蛋白质的合成与信号转导，同时Ca2+波从损伤部位至细胞核的传播也能促进神经元启动核内再生基因的表达程序[6]。此外，有研究发现神经损伤诱导的轴突内质网Ca2+的大量释放，可激活损伤部位的未折叠蛋白反应(unfold protein response，UPR)信号，而UPR信号通路的局部激活可通过控制轴突内质网和生长锥的形成促进轴突再生[7]。

    微管动力学和轴浆运输是再生过程中细胞生物学活动的前提和基础，其中动力蛋白和驱动蛋白-1在调节微管组织和轴浆转运方面发挥着关键作用。轴突损伤后局部可产生多种逆行信号分子参与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MARKs)信号转导通路，包括应激活化蛋白激酶( c-Jun N-terminal kinase, JNK)通路和细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)通路[8]。动力蛋白可将这些信号分子远距离逆行转运至细胞核，参与核内信号转导调控，启动再生程序、避免神经元凋亡[9,10]。Ducommun等[11]发现缺失动力蛋白后再生轴突无法延伸至横断部位，并认为动力蛋白是唯一负责微管逆向运输的蛋白质，如果缺失该蛋白，损伤信号的逆行传输则完全阻断。再生轴突尖端有一扇形结构称为生长锥，驱动蛋白-1主要负责细胞器以及mRNA的顺向轴浆转运，直接参与生长锥的不断延伸[12,13]。生长锥能感受微环境中的向导信号，引起自身伸展或回缩，指导轴突的延长及再生方向[14]，由F-肌动蛋白形成的无细胞器的丝状伪足从生长锥前方伸出，细胞器和囊泡等通过顺向轴浆运输来填充前端突起，最后生长锥收缩，前端突起凝集形成圆柱状轴突萌芽，再生轴突的延长主要依赖丝状伪足的动力学作为结构支撑。

    (三)SCs的重塑

    Wallerian溃变中SCs的表观遗传学发生改变以支持轴突再生，其中较为重要的2个转变是：(1)去分化，有学者认为处于分化早期的SCs对再生神经的促进作用与胚胎干细胞对再生轴突的影响相当，均可显著支持PNI后轴突再生[15]。去分化后的SCs中髓鞘形成的负调控因子氨基末端激酶(c-jun)迅速表达至较高水平，它能显著抑制髓鞘转录因子早期生长反应蛋白2(early growth response protein 2，Egr2)、胆固醇合成酶、髓鞘结构蛋白以及膜相关蛋白的编码基因的转录[16,17]，使参与髓鞘形成的SCs转化为支持轴突再生的修复性SCs。(2)激活相关基因的表达。①上调神经营养因子(neurotrophic factors, NTFs )、细胞外基质(extracellular matrix, ECM)以及新生轴突髓鞘化所需的蛋白质等多种活性物质，诱导轴突延伸，促进髓鞘形成及神经肌肉再分配；NTFs在神经元的发育、分化和神经再生方面起着关键的作用，其中胶质细胞源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor，GDNFs)是迄今为止对维持运动神经元活性作用最强的神经因子，它既能有效促进轴突生长，还能刺激SCs迁移[18]。②激活免疫反应，如分泌肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)、巨噬细胞招募和激活因子等。③SCs细胞膜表达N-钙粘连蛋白，通过SCs-SCs细胞间信息交流诱导SCs迁移至神经损伤处，在神经基膜内面重新排列形成实心细胞轴索即Bungner带[19]，Bungner带先行连接离断神经的近端和远端，引导新生轴突萌芽向远端神经生长[20,21]。④诱导α-6和β-1整合素，介导SCs与轴突接触。研究表明SCs与轴突之间的分子相互作用对轴突靶向再生以及SCs向髓鞘表型转化是不可或缺的[22]，而SCs与轴突延迟接触会导致SCs支持再生的能力大大减弱[23]。

    (四)再生轴突髓鞘化

    在周围神经系统中，髓鞘是由SCs同心包裹轴突所形成的多层膜鞘，为轴突提供电绝缘胞膜以实现快速的脉冲传导，维持神经结构完整性[24]。PNI后SCs改变细胞表型成为修复性SCs，以协调损伤后大部分的再生反应，当再生轴突髓鞘化时，修复性SCs转变为髓鞘形成细胞以恢复神经功能。在周围神经系统髓鞘发育形成的过程中，神经调节蛋白-1 Ⅲ型的调控作用已被广为认可，为一种轴性生长因子，它通过激活称为ErbBs蛋白的受体酪氨酸激酶(表皮生长因子受体的经典成员)进行一系列信号转导。有4种ErbBs受体——EGFR、ErbB2、ErbB3、ErbB4，神经调节蛋白-1 Ⅲ型与SCs表面受体ErbB2和ErbB3结合，不仅能促进SCs存活和增殖，还能参与髓鞘的形成和成熟[25]。然而再生轴突髓鞘化不是神经发育过程的简单重演，轴突损伤后会诱导SCs自分泌神经调节蛋白-1 Ⅰ型，它能有效促进再生轴突髓鞘化，并与神经调节蛋白-1 Ⅲ型对神经发育时髓鞘形成的促进作用相当[26]。在髓鞘形成的过程中，SCs被挤压成片层，2层膜通过电荷吸引而形成双层结构。研究表明，再生轴突髓鞘形成的过程中双层内2层细胞膜之间的距离明显缩短，彼此连接更为紧密并形成主要的致密线，而致密线的形成与髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)的表达水平呈正相关[27]。当SCs再次转变为髓鞘形成细胞时，其长度也将会缩短7倍，构成再生轴突经典的标志性特征即短结间区[21]。

    二、周围神经损伤后神经冲动的恢复

    周围神经纤维是有髓神经纤维，冲动的传导只能发生于富含Na+通道的郎飞结区，呈"跳跃式传导"，因此PNI后再生轴突髓鞘形成和新生郎飞结处电生理活动的恢复是再生神经兴奋性修复的2个重要事件。研究表明SCs自噬对PNI后神经冲动传导的恢复具有重要作用，它可以通过抑制损伤局部炎性反应、减少瘢痕形成、增强MBP的免疫活性、促进再生轴突髓鞘形成，实现PNI后再生神经兴奋性的恢复，避免异位放电所致的病理性神经痛[28,29,30]。有学者切断Sprague-Dawley大鼠坐骨神经并立即修复，用表面电极电刺激腓肠肌，通过透射电镜观察神经超微结构特征，发现肌肉电刺激后神经残端处自噬小体数量增加，新生有髓轴突数量及髓鞘平均厚度均显著高于对照组，并通过步态分析、神经传导检查、坐骨神经功能指数等发现运动神经的功能显著恢复[31]。然而再生轴突形成的短髓鞘导致结间长度缩短、郎飞结数目增多，神经冲动传导率较正常神经降低[32]。神经传导功能的恢复不仅和再生轴突髓鞘形成有关，还与郎飞结处Na+通道分布有关。当神经纤维损伤时，沿着轴突细胞膜分布的离子通道改变，从而导致动作电位的传导减慢或者受阻[33]。Na+通道是神经元胞体合成的，通过微管的快速轴浆运输送到远端，轴突受损时轴浆运输中断，Na+通道广泛分布于轴突质膜内[34]。再生轴突髓鞘形成时，Na+通道聚集于SCs边缘的轴突膜上，随着SCs沿着神经纤维双向延伸，Na+通道也随之而移动，最后于SCs边缘形成Na+通道聚集簇即新生郎飞结[35,36]。再生轴突能够重组离子通道从而恢复结点电流，但由于结点数目增多造成轴突内Na+积累导致钠泵活动过度，再生轴突的兴奋性在一定时期内仍处于异常状态[37]。

    三、神经趋化性再生

    神经损伤修复的结果取决于再生的轴突能否识别断端神经纤维的性质并精确长入原有的靶器官中。Forssman于1898年首次提出"神经趋向性再生"的概念[38],认为周围神经损伤后，远端神经会诱导近端新生的神经轴突向远端定向生长。Luo和Lu[38]将犬的胫神经干于腘窝处切断连接套管，术后14周切断脊髓背侧神经节，6周后做套管切片显微镜观察混合神经干不同性质的再生轴索到达远端运动支和感觉支的数量，进一步证实了混合神经中不同性质的神经纤维存在特异性趋化再生的现象。神经远端对轴突萌芽的引导作用和SCs所形成的Bungner带被认为是神经趋向性再生的重要机制[39]。此外SCs分泌的NTFs在感觉神经和运动神经中的表达及分布有所不同，在一定程度上能避免再生轴突错向生长[40]。

    四、抑制轴突再生及神经冲动恢复的因素

    (一)瘢痕形成

    神经损伤后修复部位胶原瘢痕的形成是限制神经恢复的一个主要因素，过多的瘢痕组织机械性地阻碍了神经再生并降低神经传导速率。瘢痕的形成主要与损伤的性质、程度、修复技术及神经吻合口张力有关[41]。神经损伤局部发生免疫反应，炎症细胞分泌促纤维化的细胞因子，导致ECM中成纤维细胞异常活跃，使得胶原沉积而形成大量纤维组织[41,42]。此外，损伤后局部组织易呈缺血、缺氧状态，毛细血管通透性增高造成神经内水肿，水肿则进一步导致成纤维细胞和巨噬细胞进入神经内形成纤维化。

    (二)免疫反应

    周围神经系统受到血-神经屏障作用，能阻挡淋巴细胞和抗体进入神经组织实质内，故多年来被认为是"免疫豁免区"。随着免疫组织化学技术的发展，发现主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ类抗原在病变和正常神经组织中都存在。Wang和Liu[43]发现周围神经损伤程度越重，损伤后神经局部的免疫球蛋白IgG的免疫荧光强度越强，且神经纤维再生和功能恢复与免疫球蛋白沉积量呈负相关，并认为免疫反应对神经再生起到抑制作用。目前的研究资料表明，免疫反应抑制轴突再生的机制系神经损伤后巨噬细胞浸润和炎性分子的大量释放，阻碍SCs去分化行为导致SCs损伤反应缺陷[44]。

    五、小结与展望

    显微外科的飞速发展及无张力吻合技术显著提升了周围神经损伤后外科治疗的效果，但神经损伤后常伴随精细活动的丧失，如手部活动不灵敏、面部表情不自然等，人们对PNI后神经修复效果往往有着更高的期望值，因此了解周围神经再生的潜在机制以及生物学变化，将有助于探讨促进轴突再生及恢复神经冲动传导的新策略。组织工程神经再生的研究目前备受关注，近年来已有很多研究集中于通过改善轴突再生微环境以促进轴突生长，例如应用神经导管对再生轴突加以引导[45]；通过SCs移植及干细胞工程强化神经再生能力[46,47]；利用微囊包裹、脂质体及病毒载体转染等方式可使NTFs在体内长效表达[48]；减少神经再生的抑制性因素以有效恢复神经兴奋性，例如利用生物材料复合透明质酸或脂肪干细胞抑制损伤神经与周围组织粘连、抑制炎性反应，减少瘢痕形成[42]。然而PNI后轴突再生及神经冲动恢复是生物体内高度精密的细胞学活动，目前人们对其认识还不够深刻，对神经趋化性再生机制的研究尚不全面，对再生轴突兴奋性异常等方面需要更多的探索。相信随着组织工程学、生物材料学等多学科的发展，将为跨学科促进神经损伤后修复提供更多新的思路。

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参考文献

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