巨噬细胞对皮肤创面愈合的调控机制研究进展

    皮肤创面修复是一个高度复杂的生物过程，涉及成纤维细胞、血管内皮细胞、炎症细胞的增殖和迁移、细胞因子的释放、细胞外基质成分沉积和血管新生[1]。巨噬细胞是调控皮肤创面愈合的基本细胞类型，在皮肤创面愈合过程中参与炎症反应、组织修复和塑形。然而，在糖尿病患者中，皮肤创面愈合的有序整合过程被破坏，正常修复反应不能完成，出现糖尿病溃疡等慢性皮肤创面[2]，导致截肢率增加，甚至死亡等严重后果[3]。

    一、皮肤创面相关的巨噬细胞种类

    单核巨噬细胞是天然免疫系统的主要组成部分，能够非特异性吞噬异物、细菌、衰老细胞，维持机体内环境的稳定，参与先天性和获得性免疫。皮肤巨噬细胞由组织常驻巨噬细胞和骨髓来源的单核细胞组成。损伤发生时，常驻巨噬细胞被迅速激活。骨髓来源的单核细胞，被募集到创面局部分化为巨噬细胞，是创面巨噬细胞的主要来源。

    巨噬细胞在不同的微环境中极化为2个主要的亚群：M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。促炎性M1型巨噬细胞具有较强的杀灭微生物的能力，分泌白细胞介素(interleukin, IL)-6、IL-1、诱导型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase，iNOS)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor -α，TNF-α)等促炎细胞因子，在皮肤创面愈合早期发挥重要的抗菌和抗感染作用。抗炎性M2型巨噬细胞是组织修复和重塑的关键组成部分，可以由单核细胞经IL-4和IL-13刺激转化而来，也可以由M1型巨噬细胞吞噬凋亡细胞后转化而来，后一种转化途径在创面愈合的中后期发挥关键作用。近年来人们又将M2型巨噬细胞进一步分为M2a、M2b和M2c型。暴露于IL-4和IL-13通过激活信号传导子及转录激活子(signal transducer and activator of transcription，STAT)6途径产生M2a型，沉积细胞外基质参与创面愈合；而M2b型被免疫复合物、Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)或IL-1受体拮抗剂激活；M2c型通过Janus激酶1(Janus kinase 1，JAK1)/ STAT3信号途径被IL-10、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)或糖皮质激素极化，促进纤维溶解参与组织塑形。除此之外，还有四分法将M2型巨噬细胞进一步分为M2a、M2b、M2c和M2d型。在这些分类方法中，将巨噬细胞分为M1型和M2型的二分法占主导地位，那么体内的巨噬细胞是以M1型或M2型非此即彼的极端状态存在，还是兼有M1型和M2型的特征，以一种中间体的状态存在？Nahrendorf和Swirski[4]认为简化的M1/M2模型有可能禁锢研究思路，实际存在多个巨噬细胞亚群，其中一些亚群有助于维持创面局部稳态，一些亚群促进组织修复，而另一些亚群则延缓愈合，共同构成巨噬细胞网络。皮肤创面愈合是一个连续的过程，并不是单纯处于愈合的某一个阶段。在皮肤创面愈合的不同阶段，皮肤创面局部微环境的差异、占主导地位的细胞因子改变等因素调控巨噬细胞的极化，因此皮肤创面巨噬细胞经常表现出混合表型。

    二、巨噬细胞与皮肤创面愈合的关系

    皮肤创面愈合包括3个连续的阶段：早期炎症期、中期组织形成期和后期组织塑形期。巨噬细胞在止血、炎症、生长、再上皮化和重塑等阶段发挥不同的作用，协调皮肤修复的自然进程。微环境中机械力、氧水平、趋化因子、细胞外基质和生长因子合成等的异常，直接影响巨噬细胞的募集、激活和极化。

     (一)皮肤创面愈合早期巨噬细胞对炎症的影响

    皮肤损伤激活缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)、CC基序趋化因子配体(C-C motif chemokine ligand，CCL)2、CCL3、CCL5和CXC基序趋化因子配体(C-X-C motif chemokine ligand，CXCL)等多种促炎活性分子释放，在创面附近形成浓度梯度，募集并激活创面的固有巨噬细胞[5]，参与创面清理并构建临时基质，动员间充质干细胞、成纤维细胞及角质形成细胞来完成组织再生[6]。

    巨噬细胞表达模式识别受体，通过TLRs和炎症小体信号与创面中的损伤相关分子模式(damage related molecular mode，DAMPs)和病原体相关分子模式(pathogen-related molecular patterns，PAMPs)结合，激活经典炎症途径。愈合早期的巨噬细胞以促炎性M1型为主，表面标志物为CC基序趋化因子受体(C-C motif chemokine receptor，CCR)2阳性/淋巴细胞抗原6复合体阳性，分泌IL-6、IL-1β和TNF-α，识别、吞噬并迅速杀死大多数细菌、受损细胞和基质碎片，发挥促炎和杀菌作用[7]。巨噬细胞对衰老中性粒细胞的吞噬作用[8]，以及炎症末期DAMPs和PAMPs的减少导致组织微环境的改变，诱导促炎性M1巨噬细胞表型转变为抗炎性M2细胞表型。这种表型转化对于组织修复期的细胞增殖、肉芽组织形成和血管生成非常重要，有助于促进皮肤愈合。此时期消耗巨噬细胞会抑制肉芽组织的形成和上皮化进程[9,10]。

    (二)皮肤创面愈合中期巨噬细胞对血管新生和组织形成的影响

    皮肤创面愈合中期是组织形成阶段，巨噬细胞和多种类型细胞之间的时空协调促进肉芽组织形成，填充真皮缺损。这一阶段的巨噬细胞发挥抑制炎症、修剪毛细血管床、促进血管新生，以及重塑细胞外基质结构的作用。这些作用需要M1型和M2型巨噬细胞的协同，修复早期巨噬细胞兼具M1型(即表达IL-6、iNOS和IL-1β)和M2型[即表达精氨酸酶1、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、胎盘生长因子和酪氨酸激酶受体2]的特征，修复后期的巨噬细胞主要表达M2型基因谱(即IL-10、CD163和CD206)[11]。

    皮肤创面愈合中期的巨噬细胞参与新生血管的塑形，引导血管出芽，吞噬多余的血管组织，抑制血管生成反应以防止过度血管化，从而调控血管吻合。巨噬细胞通过分泌不同的活性因子影响血管生成[12]，M1型巨噬细胞表达VEGF-A和成纤维细胞生长因子2等促进血管新生的基因，M2型巨噬细胞表达并分泌高水平的血小板衍生生长因子β(platelet-derived growth factor beta，PDGF β)(M2a型)稳定周细胞并促进出芽内皮细胞的吻合，也分泌基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)(M2c型)参与血管重塑[13]。

    巨噬细胞的极化还诱导皮肤创面处血管内皮细胞功能的恢复。增加皮肤创面组织中巨噬细胞数量和M2型巨噬细胞的比例，能够促进M2型巨噬细胞源性细胞因子IL-10和VEGF的分泌，抑制了TNF-α和IL-6，增强糖尿病血管内皮细胞的功能，促进血管生成、迁移和趋化，从而加速创面愈合[14]。在皮肤创面愈合后期，新生上皮细胞成为VEGF的主要来源，VEGF来源的转换是创面处血管新生和组织生长的关键机制[15]。巨噬细胞还促进人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblasts, HDFs)活化和细胞外基质沉积，参与肉芽组织形成过程中的纤维化反应。M2型巨噬细胞释放生长因子(如PDGF、VEGF、TGF-β1和胰岛素样生长因子1)，诱导HDFs增殖，下调M1型激活的促炎型HDFs的炎症标记物和MMPs，促进细胞外基质合成，提供皮肤创面愈合环境[16]。其中CCR1、CX3C基序趋化因子配体1-受体1和FAK-ERK-MCP1等通路与M2型巨噬细胞促进纤维化反应有关。

    皮肤创面愈合过程中血管新生和组织增殖修复是同时进行的，但是否可以区分促血管生成的巨噬细胞和促纤维化的巨噬细胞尚不清楚，可能巨噬细胞的极化状态是依赖于皮肤创面微环境中细胞和信号分子产生的连续变化，而不是明确和独立的分型。

    (三)皮肤创面愈合后期巨噬细胞对组织塑形的影响

    皮肤创面愈合后期是组织塑形期，在皮肤创面愈合过程中多种生长因子持续分泌，刺激肉芽组织不断增厚，细胞外基质沉积，创面愈合并"停止愈合"。人类皮肤创面的最后重塑阶段在受伤后2~3周开始，约持续1年。

    巨噬细胞吞噬皮肤创面愈合后不再需要的大多数细胞，调节MMPs及其内源性抑制剂，清除Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白和肌腱蛋白-C等促生长基质，维持细胞外基质的分解和转换的平衡[17]，完成组织塑形，抑制瘢痕形成。其中CXC基序趋化因子受体(C-X-C motif chemokine receptor，CXCR)3信号轴通过m-钙蛋白酶抑制生长因子诱导的成纤维细胞和内皮细胞的运动，激活μ钙蛋白酶导致内皮细胞脱落和失巢凋亡，起了重要的调控作用。治疗性激活巨噬细胞，可以吸收和降解纤维化微环境中存在的过量细胞成分，促进皮肤创面塑形。

    总之，皮肤创面愈合早期巨噬细胞在趋化因子的作用下聚集到创面处，并分化为促炎性M1型巨噬细胞发挥抗菌和抗感染作用。随着皮肤创面愈合的进展，M1型巨噬细胞顺利转化为M2型是皮肤创面愈合的基本条件。皮肤创面愈合中期巨噬细胞以M2型为主，发挥抗炎、促血管新生、促纤维化的作用，参与皮肤创面愈合和组织生成。皮肤创面愈合后期巨噬细胞吞噬多余的细胞和降解纤维组织完成组织塑形。

    三、巨噬细胞极化异常与糖尿病难愈性皮肤创面

    糖尿病是一种以高血糖、持续炎症和内皮功能障碍为特征的代谢性疾病。难愈性皮肤创面是糖尿病的典型并发症，巨噬细胞清除凋亡细胞能力受损、生长因子和趋化因子生成异常和表观遗传学调控等多种功能障碍，是导致慢性不愈合皮肤创面的重要原因[18]。

    (一)巨噬细胞吞噬功能障碍导致极化异常

    在糖尿病条件下，巨噬细胞吞噬功能受损，同时合并有晚期糖基化终产物(advanced glycation end products, AGEs)引起的细胞凋亡加速、蛋白激酶C激活和活性氧增加，促进糖尿病创面的细胞凋亡，导致炎症小体Nod样受体蛋白3持续活化、IL-1β等促炎因子增多，炎症加剧并持续存在。这种状态反过来抑制巨噬细胞由促炎表型转化为抗炎表型，炎症期延长，细胞外基质过度分解，使皮肤创面处于感染、炎症和修复不足的恶性循环中，影响创面愈合[19]。局部抑制AGEs受体信号，显示糖尿病皮肤创面中性粒细胞数量减少与巨噬细胞的吞噬作用增强相关[20]。说明糖尿病皮肤创面中巨噬细胞吞噬能力降低与糖尿病皮肤创面愈合受损密切相关。

    吞噬障碍导致皮肤创面局部铁负荷增高，抑制M1型向M2型巨噬细胞极化，也是皮肤创面难以愈合的原因。Sindrilaru和Scharffetter-Kochanek[21]观察到，糖尿病皮肤创面中巨噬细胞吞噬能力降低，导致皮肤创面巨噬细胞持续暴露于细菌、细菌壁成分脂多糖和TLRs激动剂中，组织巨噬细胞吞噬皮肤创面处的红细胞，同时诱导铁调素抑制巨噬细胞铁输出，导致铁负荷增高，激活促炎性M1型巨噬细胞群，增加TNF-α、过氧亚硝酸根(ONOO－)和氧自由基的释放。TNF-α增加促炎细胞因子(包括CCL2、CXCL1和人纤溶酶原激活物抑制剂1)的分泌[22]，通过叉头框蛋白O1介导，激活炎症因子、细胞因子、TLRs和核因子(nuclear factor，NF)κB通路的相关基因的表达。高浓度促炎性细胞因子进一步增强巨噬细胞对铁的摄取和细胞内铁的滞留，导致促炎性M1型巨噬细胞不受限制地活化，并且不能完全极化为抗炎性M2型巨噬细胞，通过p16INK4a诱导成纤维细胞衰老，抑制了皮肤创面的有效修复。糖尿病状态下游离铁增高还通过修饰HIF1α的辅因子p300，抑制HIF的激活，降低了皮肤创面对缺氧的正常反应，减少了创面周围巨噬细胞的募集和活化。

    (二)趋化因子分泌紊乱导致巨噬细胞极化异常

    趋化因子是皮肤创面愈合过程的关键调节因子，影响血管新生和炎症细胞募集。在糖尿病难愈性创面中，CCL2、CXCL2、CXCL12、CX3CR1等关键性趋化因子及受体表达异常。创面愈合早期缺乏足量和有效的促炎因子的释放，不能完成对炎症细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)的趋化和M1巨噬细胞的活化，感染和炎症加重。当皮肤创面愈合进入中期，由炎症阶段过渡到增殖和生长阶段时，糖尿病皮肤创面组织中促炎细胞因子的表达不能相应降低，甚至一直持续到创面修复的晚期，导致组织生成期和组织塑形期促炎性M1巨噬细胞不能转化为M2型巨噬细胞，影响皮肤创面愈合。

    糖尿病患者CCL2的分泌量和分泌时相异常，导致巨噬细胞不能及时募集和极化。CCL2是由中性粒细胞和巨噬细胞释放，对巨噬细胞的募集和表型转化起了重要的作用，通过激活ERK1/2、p38和JNK1/2信号通路促进创面愈合[23]。糖尿病db/db小鼠皮肤损伤后24 h时巨噬细胞炎症蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2，MIP-2)和CCL2表达降低，影响细胞趋化[24]。但是CCL2分泌持续时间延长，抑制了M1型向M2型巨噬细胞表型的转换，与皮肤创面愈合后期中性粒细胞和促炎性M1型巨噬细胞水平升高以及炎性细胞因子IL-1β和TNF-α表达增加有关，影响了皮肤创面的愈合[25,26]。近来的研究拓展了对CCL2来源和作用的了解。糖尿病小鼠皮肤创伤后表皮角质形成细胞中调控CCL2分泌的NF-κB抑制因子(NF-κB repressing factor，Nrf2)的功能失活，下调Nrf2-CCL2-EGF信号轴影响组织再生[27]。CCL2在皮肤创面愈合中的作用非常复杂，对皮肤创面愈合的调节作用仍需要进一步的研究。

    糖尿病皮肤创面局部CXCL12分泌量减少与愈合延迟相关[28]。CXCL12是M1型巨噬细胞合成的趋化因子，与免疫细胞和角质形成细胞表达的CXCR4结合，诱导巨噬细胞由M1型向M2型的极化，也能直接促进血管生成，参与创面愈合。链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠皮肤创面的炎性细胞因子诱导CXCL12失活，抑制了内皮祖细胞的趋化和归巢[29]。糖尿病db/db小鼠在受伤后7 d内表达低水平的CXCL12，使用CXCL12和氧气治疗可显著改善糖尿病创面愈合。Vågesjö等[30]使用转基因乳酸杆菌为载体，局部过表达CXCL12，增加了创面周围巨噬细胞的增殖，促进巨噬细胞表达TGF-β，加速了高血糖小鼠和人类皮肤创面的愈合，激活内皮细胞中的TGF-β / VEGFs信号传导，也能够诱导血管再生和重塑伤口愈合[31]。临床前研究也发现，局部过度表达或使用含有趋化因子(CXCL12或CCL2)的水凝胶可改善创面愈合[32,33]。

   C-X3-C基序趋化因子受体1(C-X3-C motif chemokine receptor 1，CX3CR1)和多种配体的相互作用与巨噬细胞促进纤维化反应有关。Burgess等[34]的研究证明糖尿病小鼠皮肤创面处巨噬细胞亚群的组成与正常小鼠存在差异，CX3CR1高表达的M2型巨噬细胞明显减少，炎症持续升高，导致皮肤创面愈合延迟。使用CCL2、CCL21、CXCL12和CXCR4拮抗剂以及对CC类趋化因子的广谱抑制剂可改善皮肤创面愈合过程。

    (三)表观遗传学调控导致巨噬细胞极化异常

    DNA修饰和组蛋白生化修饰是表观调控的2种主要类型。糖尿病引起的表观遗传修饰可以调节巨噬细胞和其他免疫细胞中免疫因子的表达，以及巨噬细胞由M1型向M2型的极化，是导致创面难以愈合的机制之一[35]。

    1．DNA修饰

    DNA修饰包括DNA甲基化和羟甲基化。DNA甲基化是通过DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，Dnmts)将甲基转移到DNA的胞嘧啶环上形成5-甲基胞嘧啶，主要与转录抑制有关。在哺乳动物中，体细胞中的绝大多数DNA甲基化发生在启动子内CpG岛的CpG二核苷酸簇上，通过阻碍转录因子结合而直接沉默转录，还可与组蛋白修饰酶相互作用抑制转录[36]。2型糖尿病上调Dnmt1表达，Dnmt1依赖的抑制性修饰降低了Notch1、PU.1和Krüppel样转录因子4 (Krüppel-like factor 4, Klf4)基因的表达，抑制了巨噬细胞分化，增加了促炎性M1巨噬细胞的比例[9]。反之抑制Dnmt1可促进M2型巨噬细胞的形成并促进了糖尿病db/db小鼠的皮肤创面愈合[9,37]。

    DNA羟甲基化是DNA去甲基化途径之一，与DNA甲基化相比，DNA去甲基化在糖尿病皮肤创面愈合中的作用尚不清楚，有待进一步研究。

    2．组蛋白生化修饰

    组蛋白是由2组H2A、H2B、H3和H4蛋白组成的八聚体，组蛋白修饰包括组蛋白尾部特定残基的甲基化、乙酰化、磷酸化或泛素化。根据修饰类型和被修饰的特定残基，可以激活或沉默对应基因的转录。

    糖尿病患者炎症因子的基因启动子上NF-κB结合位点的组蛋白H3甲基化异常导致巨噬细胞在创面愈合后期表现出长时间的炎症表型。有学者研究发现，糖尿病小鼠皮肤创面愈合早期的巨噬细胞组蛋白H3赖氨酸4三甲基化减少，抑制了IL-6、IL-1β、iNOS和TNFα的表达，延缓了炎症的消退[38,39]。愈合后期巨噬细胞的组蛋白H3赖氨酸4三甲基化增加使M1型巨噬细胞活性增强，阻止巨噬细胞表型转化，通过上调p16INK4a基因转录，诱导成纤维细胞衰老，影响了皮肤创面的愈合。炎症因子基因启动子NF-κB结合位点的组蛋白H3赖氨酸9被甲基转移酶SET结构域分叉组蛋白赖氨酸甲基转移酶(SET domain bifurcated histone lysine methyltransferase，SETDB2)三甲基化抑制炎症因子的转录。干扰素(interferon，IFN)β通过JAK/ STAT1途径调控巨噬细胞中SETDB2的表达。在糖尿病条件下，IFNβ-SETDB2轴受损，导致SETDB2表达下调，IL-1β、TNF-α和其他NF-κB介导的炎症因子[IL-12、IL-6、巨噬细胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)1α和MIP1β]的蛋白表达增加，糖尿病皮肤创面中促炎性M1型巨噬细胞持续存在，无法正常转化[40]。

    组蛋白H3赖氨酸27(histone H3 lysine 27，H3K27)的甲基化和去甲基化调控异常也证明与糖尿病创面难愈有关。组蛋白H3K27甲基化抑制IL-12基因启动子。在糖尿病小鼠模型中，炎症刺激巨噬细胞使以组蛋白H3K27的甲基化为靶点的含Jumonji结构域-3(jumonji domain containing-3, JMJD3)组蛋白去甲基酶的表达增加，导致组蛋白H3K27甲基化下调。2型糖尿病还降低了骨髓祖细胞组蛋白H3K27的甲基化，这种表观遗传特征被传递给终末分化的皮肤创面巨噬细胞，导致皮肤创面中IL-12分泌增加[41]。

    此外，组蛋白乙酰化异常也参与了糖尿病皮肤创面难愈。赖氨酸乙酰转移酶8(lysine acetyltransferase 8，KAT8)是组蛋白乙酰转移化酶的一种，特异性乙酰化组蛋白H4尾部上的赖氨酸16(histone H4 lysine 16，H4K16)并促进基因转录。在饮食诱导肥胖(diet-induced obesity，DIO)小鼠和人类2型糖尿病皮肤创面中，TNF-α驱动巨噬细胞中KAT8过度表达，通过组蛋白H4K16的乙酰化促进IL-1β、TNF和一氧化氮合酶2等炎症因子的表达，干扰巨噬细胞的表型转化和皮肤创面愈合。TNF-α抑制剂局部治疗可加快DIO小鼠的皮肤创面愈合，并降低皮肤创面巨噬细胞的KAT8水平[42]。KAT8还通过乙酰化干扰素调节因子3抑制IFNⅠ表达，IFNⅠ的下调抑制SETDB2，通过组蛋白甲基化途径协同影响巨噬细胞极化[40,43]。

    四、小结与展望

    在皮肤创伤愈合的各个阶段，巨噬细胞的动态和可逆的表型变化起着重要的作用。糖尿病患者巨噬细胞不能从促炎性M1巨噬细胞转变为组织重塑和修复所需的抗炎性M2型巨噬细胞，损害了皮肤创面愈合。随着单细胞分析技术的发展和应用，对皮肤创面愈合过程中巨噬细胞表型谱进行精准描述，才能更好地研究皮肤创面愈合中巨噬细胞表型的时空调控。在糖尿病皮肤创面愈合过程中靶向巨噬细胞功能障碍，调控巨噬细胞极化的策略可能是提高愈合效果的一种途径。

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参考文献

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第十一期内容

中国汉族人筛骨垂直板三维解剖测量

巨噬细胞在组织再生中的调控作用

间充质干细胞诱导巨噬细胞极化促进创面愈合的研究进展

巨噬细胞在自体脂肪移植中作用机制的研究进展