低氧诱导因子-1α在小耳畸形耳软骨细胞中的表达及差异分析

低氧诱导因子-1α在小耳畸形耳软骨细胞中的表达及差异分析

尚巧利何乐人

本文来源：《中华整形外科杂志》2023年4月第39卷第4期

DOI:10. 3760 / cma.j.cn114453-20230222-00038

作者单位：中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院外耳整形再造一科，北京100144

通信作者：何乐人，Email:heleren@sina.com

引用本文

低氧诱导因子-1α在小耳畸形耳软骨细胞中的表达及差异分析 [J] . 中华整形外科杂志, 2023, 39(4) : 428-434. DOI: 10.3760/cma.j.cn114453-20230222-00038.

【摘要】

目的探索低氧诱导因子-1α(HIF-1α)在不同严重程度的先天性小耳畸形与正常耳软骨细胞中的表达及与氧浓度的关系。

方法收集2021年9月1日至2022年10月31日中国医学科学院整形外科医院收治的单侧先天性小耳畸形患者耳软骨标本，耳垂型小耳6例(实验组1)，甲腔型小耳6例(实验组2)，正常耳6例(实验组3)。分别提取原代耳软骨细胞，将P2代细胞分别置于氧浓度为21%、10%、5%和1%的培养箱中培养12 h，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测HIF-1α在mRNA水平的表达，采用免疫荧光染色法检测HIF-1α蛋白在软骨细胞中的表达情况。采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果 RT-qPCR结果显示，氧浓度21%、10%、5%、1%条件下各组耳软骨细胞的HIF-1α mRNA相对表达量：实验组1分别为0.031 8±0.006 0、0.043 4±0.001 0、0.049 5±0.000 9、0.030 5±0.001 0，实验组2分别为0.036 9±0.000 6、0.047 4±0.000 8、0.054 1±0.000 4、0.034 1±0.001 8，实验组3分别为0.041 6±0.000 4、0.055 6±0.000 6、0.070 1±0.001 9、0.077 2±0.000 9，其中，21%、5%氧浓度培养条件下3组间差异有统计学意义(P<0.01)。免疫荧光染色显示，在5%氧浓度时，实验组1和实验组2中HIF-1α蛋白部分位于细胞核，部分位于细胞质，实验组3中HIF-1α蛋白位于细胞核中。

结论 HIF-1α在耳垂型、甲腔型先天性小耳畸形及正常耳软骨细胞中均有表达，表达量与畸形严重程度呈负相关；氧浓度在21%到1%之间变化时，HIF-1α mRNA在耳垂型和甲腔型先天性小耳畸形中的变化趋势相似，表达量与畸形严重程度呈负相关，且峰值出现在5%氧浓度，1%氧浓度时表达下降，但在正常耳软骨细胞中表达持续增加；5%氧浓度时小耳畸形耳软骨细胞中HIF-1α蛋白的核内外分布情况与正常耳软骨细胞不同。

【关键词】先天性小耳畸形；低氧诱导因子；氧浓度；出生缺陷

基金项目： 首都卫生发展科研专项（2022-2-4042）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2021-I2M-1-001）

Expression and analysis of hypoxia-inducible factor-1α in congenital microtia chondrocytes

Shang Qiaoli, He Leren

The First Department of Ear Reconstruction, Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100144, China

Corresponding author: He Leren, Email: heleren@sina.com

【Abstract】

Objective To explore the expression of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) in different types of congenital microtia chondrocytes and normal ear chondrocytes, and the relationship with oxygen concentrations.

Methods The experimental samples were from the patients with unilateral congenital microtia admitted to Plastic Surgery Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences during September 1st, 2021 to October 31st, 2022, including 6 cases of unilateral lobular type congenital microtia (experimental group 1), 6 cases of conchal type (experimental group 2), and 6 cases of normal ear cartilage (experimental group 3). And auricle chondrocytes of each group were extracted respectively. The chondrocytes of each group were cultured in an incubator with an oxygen concentrations of 21%, 10%, 5%, and 1% respectively. After 12 h, total RNA was collected and the expression of HIF-1α at the mRNA level was detected by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). Immunofluorescence staining was used to detect the expression of HIF-1α protein in chondrocytes. Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 8.0 software. One-way ANOVA was used for comparison between groups, and SNK test was used for pairwise comparison. P<0.05 was considered statistically significant.

Results RT-qPCR results showed the relative expression levels of HIF-1α mRNA in ear chondrocytes under 21%, 10%, 5%, and 1% oxygen concentrations. In experimental group 1 the relative expression levels of HIF-1α mRNA were 0.031 8±0.006 0, 0.043 4±0.001 0, 0.049 5±0.000 9, 0.030 5±0.001 0 respectively; experimental group 2, 0.036 9±0.000 6, 0.047 4±0.000 8, 0.054 1±0.000 4, 0.034 1±0.001 8 respectively; experimental group 3, 0.041 6±0.000 4, 0.055 6±0.000 6, 0.070 1±0.001 9, 0.077 2±0.000 9 respectively; the difference of relative expression of HIF-1α mRNA in the three groups was statistically significant under the condition of 21% and 5% oxygen concentration (P<0.01). Immunofluorescence staining showed that the HIF-1α protein in experimental groups 1 and 2 was partially located in the nucleus and partially located in the cytoplasm, while in the experimental group 3 it was located in the nucleus at 5% oxygen concentration.

Conclusion HIF-1α is expressed in both types of lobular and conchal congenital microtia and normal ear chondrocytes, and the expression level is negatively correlated with the severity of the deformity. When oxygen concentration varied from 21% to 1%, the changing trend of HIF-1α mRNA in type lobular and type conchal microtia is similar, and the expression level is negatively correlated with the severity of the abnormality, and the peak value appeared at 5% oxygen concentration, decreased at 1% oxygen concentration, but continued to increase in normal ear chondrocytes. At 5% oxygen concentration, the location of HIF-1α protein in the nucleus of chondrocytes with microtia is different from normal chondrocytes.

【Key words】Congenital microtia; Hypoxia-inducible factor; Oxygen concentration; Birth defect

Fund program: Capital’s Funds for Health Improvement and Research (2022-2-4042); CAMS Innovation Fund for Medical Science (CIFMS) (2021-I2M-1-001)

Disclosure of Conflicts of Interest: The authors have no financial interest to declare in relation to the content of this article.

Ethical Approval: Ethical approval was given by the Medical Ethics Committee of Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (202253).

氧在需氧生物的代谢、能量产生和细胞稳态中起着重要作用[1]。低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)是细胞、组织、器官及生理系统应对低氧刺激的关键因子之一，HIF-1α是主要的氧调节亚基，可调控软骨基质的分泌、红细胞的生成、血管化、细胞增殖与分化及代谢重编程等[2,3]。HIF-1α条件性敲除小鼠胚胎发育出现异常甚至死亡，影响心肺循环、神经系统及耳廓软骨的发育[4]。先天性小耳畸形是一种常见的体表出生缺陷，已有报道的发病率差别较大，学者们从环境因素、基因组及代谢组等方面探究其病因，但目前尚不明确[5,6]。临床中观察到先天性小耳畸形严重程度不一，既往研究主要关注小耳畸形与正常耳软骨之间的差异，罕见针对不同严重程度的小耳畸形的研究，且前期我们发现HIF-1α在重度小耳畸形软骨组织中的表达低于正常耳软骨[7]，但HIF-1α的表达是否与小耳畸形严重程度有关目前鲜见报道，故本研究根据严重程度对小耳畸形进行分组，检测其HIF-1α的表达及与氧浓度的关系。

材料与方法

一、标本来源

收集2021年9月1日至2022年10月31日中国医学科学院整形外科医院收治的单侧单纯型先天性小耳畸形患者耳软骨标本，年龄7~11岁，无其他发育异常，耳垂型小耳畸形6例(实验组1)，甲腔型小耳畸形6例(实验组2)，正常耳6例(实验组3)(图1)。

本研究经中国医学科学院整形外科医院伦理委员会批准(2022注册第53号)。患者及家属均签署知情同意书。

二、主要试剂与仪器

DMEM高糖培养基(Hyclone，美国)、胎牛血清(Invitrogen，美国)、0.25%胰蛋白酶(Hyclone，美国)、Ⅳ型胶原酶(Sigma，美国)、青霉素-链霉素溶液(Hyclone，美国)、磷酸盐缓冲液DPBS(Hyclone，美国)、TRIZOL试剂(Ambion，美国)、Oligo(dT)15(Promoga，美国)、LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master(Roche，瑞士)、4%多聚甲醛固定液(碧云天，中国)、兔源HIF-1α单克隆抗体(ab51608，Abcam，英国)、山羊抗兔IgG H&L(Abcam，英国)、化学发光法显影试剂盒(碧云天，中国)。分光光度计NanoDrop 2000c(Thermo，美国)、LightCycler®96实时荧光定量PCR仪(Roche，瑞士)、普通光学显微镜(Olympus，日本)、共聚焦荧光显微镜(Leica，德国)、恒温二氧化碳培养箱(Thermo，美国)、CelCulture系列CO2培养箱(Esco，新加坡)、恒温摇床(上海智诚分析仪有限公司，中国)、超净工作台(上海博讯实验器材公司，中国)。

三、软骨细胞的分离培养及扩增

标本离体后置于含1%双抗(青霉素、链霉素)的磷酸盐缓冲液中，放入冰盒转移至超净工作台，反复以含1%双抗的磷酸盐缓冲液冲洗，并剔除软骨包膜及包膜外软组织，将软骨剪成1 mm×1 mm的小块，加0.25%胰酶置于恒温摇床，80~100 r/min, 30 min,离心后弃上清，加0.2%Ⅳ型胶原酶置于恒温摇床，80~100 r/min，10~12 h，细胞筛过滤收集滤液，100 g离心5 min，弃上清，以含0.1%双抗及10%胎牛血清的高糖培养基重悬细胞沉淀，按照5×105个细胞/cm2的密度接种于10 cm无菌培养皿中，置于恒温培养箱培养，3 d更换1次新鲜培养基，细胞融合至80%时进行传代扩增，取P2代细胞进行后续实验。

四、不同氧浓度培养条件的设置及分组

各组P2代细胞贴壁后分别置于恒温培养箱(21%O2，5%CO2，37 ℃)和氧浓度设置为10%、5%、1%的CelCulture系列CO2培养箱(5%CO2，37 ℃)中培养12 h取出，显微镜下观察细胞形态并记录，再进行后续实验。

五、实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)检测基因表达

收集各组细胞，使用TRIZOL试剂提取细胞总RNA，分光光度计测量RNA浓度，将A260/A280比值达到1.8~2.0者反转录为cDNA进行PCR扩增。反应条件：95 ℃ 300 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共45个循环。引物序列委托北京西贝宏程生物科技有限公司合成，见表1。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内参基因，用2－△CT法计算目的基因的相对表达量。

六、免疫荧光染色检测目的蛋白的分布

取各组细胞4×104个接种于共聚焦小皿中，待细胞贴壁融合至60%时染色，弃培养基，用磷酸盐缓冲液清洗5 min，2次，4%多聚甲醛固定液固定15~30 min,磷酸盐缓冲液清洗，0.1%Triton X-100破膜，1%BSA清洗，10%山羊血清封闭，37 ℃ 40 min,吸走多余血清，加兔抗HIF-1α(1∶100)4 ℃孵育过夜，室温恢复45 min，加二抗(1∶1 000)37 ℃孵育45 min, 0.1%BSA清洗，DAPI染核封片，共聚焦荧光显微镜拍照记录。

七、统计学分析

使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，计量资料数据用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

结　果

一、耳软骨细胞的提取及传代观察

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