肥大细胞在神经纤维瘤中的作用及机制

   Ⅰ型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type 1，NF1)是一种常染色体显性遗传病，各种族间患病率大致相等，约为1/3 500,是一种最常见的神经皮肤综合征[1]。该病是由定位于17q11.2染色体的NF1基因发生突变引起，其中高达50%为散发突变[2]。基因突变后获得的编码产物神经纤维蛋白，一种GTPase激活蛋白(GTPase-activating protein，GAP)可加速有活性的p21ras-GTP向无活性的p21ras-GDP转化[3]，因失去正常功能，造成细胞内RAS-GTP下游信号通路表达上调，从而引发一系列相关临床表现[4]。常见的NF1临床表现包括神经纤维瘤、皮肤牛奶咖啡斑、腋窝下或腹股沟区雀斑、视神经胶质瘤、Lisch结节、脊柱侧弯等，其中以神经纤维瘤最常见[5,6]。

    一、神经纤维瘤分类与细胞组分

    神经纤维瘤发生在周围神经系统中可表现为不同的形式，多在儿童期发病，青春期和妊娠期达到高峰。在临床上主要分为3种亚型[7]：(1)皮肤型神经纤维瘤，主要分布在躯干和面部皮肤表面，多呈粉红色，质地柔软，可带蒂生长，肿物数量与大小在患者中差异较大。(2)皮下型神经纤维瘤，肿瘤多沿皮神经方向生长，在皮下似滚珠样结节，有一定的移动范围，按压可引起感觉异常、疼痛或放射痛。(3)丛状神经纤维瘤，肿瘤主要沿内神经丛弥漫性生长，常伴有皮肤和皮下组织的大量增生，引起病变区域的增厚肥大。该类型若出现在面部区域，可造成严重的面容畸形、功能损害；若发生在四肢，可导致患者的身体感觉与活动出现严重障碍。此外，与其他亚型相比，丛状神经纤维瘤具有更高转变为恶性神经纤维瘤的风险，这也是造成NF1患者早期死亡的主要原因之一[8]。尽管目前有相关药物如MEK抑制剂在实验动物模型[9]和临床试验的早期阶段对肿瘤的治疗显示出一定的作用[10,11]，但现阶段对神经纤维瘤患者的临床治疗方案仍以手术切除为主[12]。

    神经纤维瘤主要是由施万细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、致密胶原等多种成分组成的异质性肿瘤[13,14]。此外，在神经纤维瘤中还可经常观察到肥大细胞的浸润[15,16]，循环血清和肿瘤局部也可分别检测到较高水平的免疫球蛋白E[17]和组胺[18]。这一特征在其他类型的肿瘤中并不常见，因此使肥大细胞成为研究神经纤维瘤的热点之一，并将多种炎症因素与该肿瘤的发生发展联系在一起。本文就目前在神经纤维瘤中有关肥大细胞研究的进展进行汇总并提出潜在的进一步研究方向。

    二、肥大细胞在神经纤维瘤中的特点

    (一)肿瘤微环境中肥大细胞的脱颗粒反应

    肥大细胞起源于骨髓多能祖细胞，以未成熟的前体形态从骨髓迁移出去，在外周组织中逐渐分化成熟。在这个过程中肥大细胞表面可形成多种类型的受体，它们之间的表达差异可让肥大细胞被不同的外界信号激活，从而表现出功能多样性和表型重塑性[19]。多项研究已证实，在肿瘤微环境形成阶段，组织中浸润的肥大细胞会通过脱颗粒反应释放趋化因子配体(C-C motif chemokine ligand，CCL)2、5等多种趋化因子，以及白介素(interleukin，IL)3、6、8等细胞因子来调节肿瘤的发展[20]。同时，在肿瘤形成发展的过程中肥大细胞也可通过分泌多种生长因子，例如转化生长因子β、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子和成纤维细胞生长因子等，实现非免疫活动，从而促进新生血管生成、细胞外基质重塑和创面组织修复、纤维化等[21]。

    随着对神经纤维瘤组织微环境的逐步探索，人们发现在肿瘤形成初期就出现浸润的肥大细胞，可脱颗粒释放多种超出正常表达水平的炎症因子和生长因子，作用于组织内的施万细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等，在促进神经纤维瘤的生长发育方面起到至关重要的作用[22]。有临床案例报道指出，1例NF1患儿在接受了3个月的甲磺酸伊马替尼(多种受体和非受体酪氨酸激酶抑制剂)治疗后，体内的丛状神经纤维瘤体积减少了1/3[23]，提示在神经纤维瘤形成发展的过程中，免疫细胞尤其是肥大细胞的代谢是一个潜在的可药物治疗靶点。但不能忽略的是，不同患者的神经纤维瘤体在形成过程中存在显著异质性。同时患者对于不同药物的反应也存在明显差异，提示肥大细胞在发挥作用的过程中可能存在尚未明确的分子分型。因此，在神经纤维瘤形成的组织微环境中进一步探索与肥大细胞相关的分子信号机制对NF1患者的治疗仍具有重要的研究意义与临床价值。

    (二)肿瘤微环境中肥大细胞的NF1杂合性

    除了多种细胞因子的释放外，肥大细胞的NF1杂合性也被认为是神经纤维瘤发展的关键因素。起初，NF1基因杂合表达的重要性是研究人员通过利用Krox20启动子驱动Cre-loxP技术将靶细胞中的NF1基因敲除所发现的。在NF1flox/flox Krox20-Cre小鼠未成瘤的情况下，NF1flox/-Krox20-Cre小鼠表现出了类似于NF1患者身上可发生的丛状神经纤维瘤[24]，突出了NF1+/－在肿瘤微环境中的重要地位。此外，Yang等[25]进一步通过骨髓移植实验强调了在NF1+/－非肿瘤细胞系中骨髓造血细胞在肿瘤发生过程中可发挥关键作用，提示NF1+/－肥大细胞是维持神经纤维瘤微环境的关键因素。在多项研究中也已证实，与NF1+/+肥大细胞相比，NF1+/－肥大细胞可分泌更多的促纤维化生长因子，如转化生长因子、血小板源性生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，在促进肿瘤内相关细胞的增殖分化和细胞外基质的沉积方面发挥更强的作用[26]。

    三、肥大细胞在神经纤维瘤中发挥作用的相关机制(表1)

    (一)SCF/c-Kit信号通路

    研究表明，在分化成熟的肥大细胞表面表达的多个受体中，c-Kit可被体内细胞释放的干细胞因子(stem cell factor，SCF)激活，产生的信号可促进自身增殖与存活。同时，SCF/c-Kit信号通路还可对肥大细胞产生较强的趋化作用，诱导细胞从循环血液迁移进入局部组织[27,28]。此外，SCF还能促进肥大细胞胞内颗粒的新合成及释放，增加肿瘤组织中与生长相关因子的浓度[29]。因此，鉴定在肿瘤微环境中可表达SCF的细胞对于探究肥大细胞在神经纤维瘤中产生浸润并进一步发挥作用的现象具有重要意义。有体外实验表明，施万细胞可表达SCF，并发挥了诱导肥大细胞迁移的作用[30]。此外，有实验利用SCF-GFP转基因小鼠(SCF启动子驱动的GFP)进一步观察显示，在正常和丛状神经纤维瘤周围神经组织中均有SCF表达，且与正常施万细胞相比，NF1－/－施万细胞可表达更高水平的SCF[31]。研究也发现敲减施万细胞的c-Kit受体基因表达或在培养基中加入封闭c-Kit受体的抗体均可减小对肥大细胞产生的增殖趋化效应，进一步表明在神经纤维瘤中施万细胞可能是SCF的体内来源，产生的SCF/c-Kit信号介导肥大细胞在肿瘤组织中的浸润[32]。

    (二)RAS信号通路

    很多研究发现在肥大细胞的行为改变过程中RAS依赖的网络信号起到了关键作用，其中研究最为明确的是Ras/Raf/Mek/Erk信号通路[33]。

    NF－/－施万细胞异常分泌的SCF激活肥大细胞表面的c-Kit受体后，活化的受体可直接结合生长因子受体结合蛋白(growth factor receptor-bound protein 2，Grb2)。两者的结合可促进鸟苷酸交换因子(GMP exchange factor，GEF)蛋白定位在与Ras相邻的细胞膜上，与Ras形成复合体。复合体的形成可促进GTP取代与Ras相连的GDP，从而激活Ras及后续相关的信号通路，从而引起NF+/－肥大细胞高度活化的病理表现。

    Ras活化后可招募Raf到细胞膜，通过与自身结合而将其激活。活化的Raf可进一步磷酸化Mek1和Mek2上的多个丝氨酸残基而将其活化。由于Mek1和Mek2本身是酪氨酸和苏氨酸/丝氨酸双特异性激酶，随后可磷酸化Erk1和Erk2中的苏氨酸和酪氨酸残基，从而激活二者。活化状态的Erk1/2进入到细胞核，激活多种转录因子，最终引起效应蛋白的合成，导致肥大细胞的增殖变化。相关药物如MEK抑制剂在实验动物模型和临床试验的早期阶段对肿瘤的生长显示出一定的抑制作用，突出了肥大细胞内Ras/Raf/Mek/Erk信号通路在肿瘤形成发展过程中发挥的重要作用。

    随着研究的不断深入，人们开始了解Ras亚型(H、N、K)在肥大细胞中可发挥的功能。Khalaf等[33]在体内外实验中发现，NF+/－肥大细胞的功能活动以K-ras基因剂量依赖性的方式减弱，明确了在c-Kit信号介导的肥大细胞增殖、存活、迁移和脱颗粒的过程中K-ras发挥着关键作用，进一步补充完善了Ras通路在NF+/－肥大细胞中发挥效应的机制。

    (三)PI3K信号通路

   在肿瘤微环境中除了Ras/Raf/Mek/Erk信号通路以外，PI3K/Rac/Pak/p38信号通路在SCF/c-Kit激活的肥大细胞内也发生了明显的表达上调。结合多个基因敲除小鼠模型以及通过使用针对MEK、PI3K和p38的不同化学抑制剂处理细胞，可以发现Ras/Raf/Mek/Erk信号通路主要调节肥大细胞的增殖和细胞因子合成，而PI3K/Rac2/Pak/p38途径在调节胞内肌动蛋白重排和细胞运动方面起重要作用[34]。同时，该研究结果发现PI3K抑制剂对肥大细胞增殖产生了阻滞效果。为探索这一机制而展开的生化研究表明，Raf/Mek/Erk级联反应和依赖PI3K的级联反应之间可以通过Pak产生联系。Pak通过丝氨酸338促进Raf1磷酸活化，从而促进Raf1通过丝氨酸217/222增强Mek磷酸化。此外，Pak1还可以直接通过丝氨酸289促进Mek磷酸化。这2种途径均增强了下游信号分子细胞外信号调节激酶Erk1与Erk2磷酸化，活化的Erk1/2可促进细胞质内相关靶因子(如p90rsk)易位到核内，活化与之相关的生长转录因子如Elk1，加快细胞周期由G1期转变到S期，加快细胞增殖速度[35]。另有研究表明，Rac2——一种造血Rho GTP酶同工型，可以促进Akt磷酸化，从而调节Bcl-2家族蛋白表达，防止细胞凋亡，增加其存活率[36]。

    (四)其他相关通路

    在临床试验中不可忽略部分神经纤维瘤患者对Kit抑制剂治疗无反应，提示我们除了SCF/c-Kit信号通路外可能还有其他机制参与了肥大细胞生物行为改变的调节。最近有研究表明，在皮肤神经纤维瘤中靶向抑制肥大细胞内PLCγ/Akt/p-IκBα/p65信号通路可以降低该细胞在肿瘤微环境中的炎症活性以及抑制相关肿瘤细胞的增殖[36]。此外，通过结合多数皮肤神经纤维瘤在青春期会出现快速进展的临床特征，有研究发现在该肿瘤中雄激素受体的表达与肥大细胞密度呈正相关，主要机制是由于雄激素受体的表达可促进Hippo信号通路中转录共激活因子YAP与TEA结构域转录因子之间的相互作用，增加体内肾上腺髓质素的表达，该激素可进一步促进肥大细胞在皮肤神经纤维瘤中的浸润[37]。此外，在青春期时丛状神经纤维瘤转化为恶性肿瘤或术后复发的概率也会增加，因此该机制的发现可能为临床上治疗皮肤和丛状神经纤维瘤提供新的线索和方案。

    四、总结与展望

    虽然在不同类型的神经纤维瘤发生发展过程中肥大细胞的浸润均起到了很重要的作用，但一些研究发现在通过去除施万细胞SCF的表达来降低肥大细胞在丛状神经纤维瘤组织的浸润程度后，肿瘤发生事件并没有出现明显改变[38]。我们可以推测虽然阻止施万细胞中SCF表达可明显减少神经纤维瘤中肥大细胞的浸润，但出现的细胞数量可能仍高于肿瘤形成的阈值水平。施万细胞分泌的SCF可能是招募肥大细胞的关键但不是唯一来源，来自其他细胞的SCF在招募肥大细胞浸润的过程中也发挥着重要作用。这可能也是通过靶向消融或伊马替尼药理抑制Kit受体可在一定程度上抑制神经纤维瘤发展的原因。在将来研究中可利用成纤维细胞或内皮细胞特异性NF1基因敲除小鼠模型来进一步探索SCF在神经纤维瘤中的作用，以及寻找在神经纤维瘤组织中肥大细胞诱导肿瘤发生可能存在的最低浸润水平。

    在观察神经纤维瘤组织微环境的过程中人们也发现，与正常组织相比，除肥大细胞以外的其他炎症相关细胞，如中性粒细胞、巨噬细胞在不同类型神经纤维瘤组织中的数量也出现成倍增加[39]。此外，在一些肿瘤中如结肠癌，肥大细胞会释放一些细胞因子促进其他免疫调节细胞的生长发育、极化或从抗肿瘤性转向促肿瘤性，从而共同构成肿瘤复杂的免疫微环境[40]。因此，在研究神经纤维瘤进展的过程中，我们不仅仅要把重点放在肥大细胞与施万旺细胞、成纤维细胞等肿瘤相关细胞的相互作用上，还需要进一步增加对肥大细胞与其他炎症细胞相互联系的关注。相信未来进一步加强对神经纤维瘤组织微环境中肥大细胞与其他免疫细胞相互调节机制的探索，以及这些细胞进一步会对肿瘤进展产生的作用，将有助于我们在靶向调节肿瘤免疫环境方面找到有效治疗神经纤维瘤的途径，完善临床治疗方案的同时提高治疗效果与患者预后质量。

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参考文献

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第十二期内容

不同类型支架鼻整形术的回顾性研究

手术切除联合射频消融在颜面部丛状神经纤维瘤治疗中的应用

1型神经纤维瘤病的整形外科治疗决策

Ⅰ型神经纤维瘤病相关丛状神经纤维瘤的药物临床试验进展