去铁胺应用于脂肪移植领域的研究进展

    自1893年Neuber报道了小块游离自体脂肪移植在面部缺损治疗中的应用以后，自体脂肪移植便作为一种修复软组织缺损和填充凹陷的技术，在整形美容外科领域得到越来越广泛的应用。然而，临床上脂肪移植物的存活率差异很大，波动在10%~80%之间[1]。为了解决该问题，学者们针对自体脂肪移植过程中的关键步骤进行了很多研究[2,3,4]。去铁胺(deferoxamine)是一种铁螯合剂，主要应用于急性铁中毒、慢性铁超载等疾病的治疗[5]。除了铁鳌合作用以外，去铁胺还具有促进血管形成、抗氧化应激等多种作用[6,7]，这扩大了它的应用范围。近年来，有学者对去铁胺促进自体脂肪移植存活的作用进行了实验研究，并取得新的进展。本文对自体脂肪移植领域相关研究中去铁胺的给药方式、浓度和作用机制等进行综述，以为研究者提供参考。

     一、脂肪移植物的存活机制

    目前公认的脂肪移植物存活机制有移植物存活理论和宿主替代理论，随着许多学者的不断研究，两种理论也在当今取得了不断的完善和发展。

    (一)移植物存活理论

    脂肪移植物存活理论由Peer[8]于1950年提出，他认为脂肪移植物通过与宿主血管吻合建立血液循环而存活。这使我们对脂肪移植物在移植后如何存活有了基本认识。此后，1994年Carpaneda和Ribeiro[9]发现仅在血管化组织的边缘2 mm内的脂肪移植物可以通过接触受区组织、吸收血浆而存活，继而发生移植物的血运重建。所以，目前在临床中进行脂肪移植时常采用多通道、多平面、极少量的注射方式，这种方式可以促进脂肪移植物与受区部位最大化接触，确保移植后血液循环的建立。

    2012年，Zhao等[10]报道了一项研究，使得我们可以更好地理解脂肪移植物在体内是如何存活的；同时，基于他们可靠的研究结论，移植物存活理论可以进一步建立。Zhao等[10]在实验中将C57BL/6-gfp小鼠和C57BL/6小鼠随机配对后，从二者的腹股沟分别取出约0.2 ml的脂肪组织，制备成颗粒脂肪，互换移植，分别在移植后的第3天、第7天、2周、4周、2个月、3个月和4个月采集样本，检测新生血管的来源。他们认为，在脂肪移植后的血运重建过程中，新生血管是从受区部位开始生长，为移植物提供血供，促进其成活。这项研究的证据令人信服，但并不能解释临床观察到的脂肪移植血运重建过程中的所有表现，因此移植物的存活可能还存在其他机制。

    (二)宿主替代理论

    最初的宿主替代理论是由Neuhof[11]在1923年首先提出，他认为移植的脂肪细胞不会存活，而是由宿主间质细胞吞噬、降解坏死的脂肪细胞后所释放的脂质形成新的脂肪组织。

    Yoshimura等[12]通过切断供应小鼠腹股沟脂肪垫的血管，建立了一个缺血模型，检测了脂肪细胞在3种不同程度(轻、中、重度)缺血状态下的存活情况。他们发现，移植物中并不是所有的细胞都不能成活，脂肪细胞在缺血条件下容易死亡，但脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)可以存活，并被激活，有助于脂肪组织的修复。这证明补充ADSCs或脂肪来源祖细胞可以增强和加速缺血状态下脂肪组织的修复过程。Yoshimura等[12]还做了进一步的研究，他们观察到从移植物外围到中心存在3个区域：(1)存活区，脂肪细胞存活；(2)再生区，脂肪细胞死亡但干细胞存活，死亡的脂肪细胞被新的脂肪细胞取代；(3)坏死区，脂肪细胞和干细胞都死亡。这项研究显示只有一小部分脂肪细胞在部分缺血的条件下能存活；再生区的大多数脂肪细胞可以通过ADSCs的激活而存活。该研究展示了脂肪细胞早期死亡和脂肪细胞通过ADSCs或祖细胞的活化和再生而被替代的证据。

    每种理论都可能在脂肪移植物存活中发挥作用，以脂肪细胞的各种成活机制为基础，去铁胺能够应用于脂肪移植领域，与它的促血管生成、激活并保护干细胞等作用是分不开的。

    二、去铁胺的药物作用

    (一)促血管生成

    大部分来自脂肪移植物的成熟脂肪细胞都不能经受缺血-再灌注损伤，并在移植后第1天死亡[13]。因此，新血管的形成对移植物的存活至关重要。

Tang等[14]研究发现，将去铁胺溶解在生理盐水中，注射于脊髓损伤的大鼠腹腔内，剂量为30或100 mg/kg，持续1周或2周，在损伤的脊髓中可见新血管的形成增加。同时，大鼠脊髓损伤症状得到明显改善，运动功能障碍减轻，电生理传导改善。这表明去铁胺可以通过促进新生血管形成来改善大鼠压迫性脊髓损伤。

    在糖尿病模型中也有类似的证据。Ram等[15]在实验中应用1%的去铁胺软膏涂抹糖尿病大鼠胸背部的慢性创面，从第7天起，伤口闭合的比例明显高于只涂抹蜡脂药膏的对照组；在第3、7和14天，缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基质细胞衍生因子(stromal cell derived factor-1，SDF-1)等促血管生成的因子及其蛋白水平显著升高；同时CD31免疫组织化学染色也显示，去铁胺组的新生血管数量明显更多。这提示局部应用去铁胺软膏可增加新生血管的形成，可能有助于糖尿病患者皮肤创面的愈合。

    上述实验证明去铁胺具有重要的促血管生成作用，这也是去铁胺可以应用于脂肪移植领域的理论基础。

    (二)激活和保护干细胞

尽管ADSCs在脂肪移植物存活的过程中具有非常重要的作用，但细胞凋亡导致的细胞死亡限制了其治疗效果。骨髓间充质干细胞在移植后1 d存活率不到1%[16,17,18,19]，其中氧化应激是导致干细胞大规模死亡的重要原因。很多实验研究证明去铁胺可以激活干细胞的再生潜力，并保护干细胞，减少氧化应激对它的损伤。

    1．激活干细胞

    自体干细胞用途广泛，在医学界常被称为"万用细胞"，其中ADSCs易获得，其可通过旁分泌生长因子和细胞因子，用于多种疾病的治疗。但在糖尿病患者中，ADSCs的功能通常会受到影响。Hopfner等[20]设计了一个实验，在体外用150和300 μmol/L的去铁胺预处理糖尿病患者ADSCs，分析其再生细胞因子的表达，检测其体外和体内血管生成能力；此外，他们还建立了糖尿病小鼠创面愈合模型，以评估去铁胺预处理后细胞的再生能力。结果显示，去铁胺预处理后通过上调HIF-1α水平来增强糖尿病患者ADSCs中VEGF的表达，使得ADSCs在体外和体内的血管生成能力明显增强；在糖尿病小鼠创面愈合模型中进一步证实了去铁胺预处理后ADSCs的再生功能增强。这也验证了去铁胺治疗糖尿病相关创面愈合的效果。

    2．抗氧化应激保护干细胞

    氧化应激是导致干细胞移植后损伤的重要原因，约99%的细胞因应激微环境而被破坏。由于铁可以通过芬顿反应产生活性氧，因此铁超载可能为产生氧化应激的重要因素[21]。Khoshlahni等[22]发现采用5 μmol/L去铁胺预处理的骨髓间充质干细胞存活率显著提高，过氧化氢诱导的凋亡相关蛋白表达水平下降，抗凋亡途径磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶通路(phosphoinositide 3-kinase pathway，PI3K/AKT)中的效应物pAKT也明显上调，证实通过去铁胺耗竭铁可以提高骨髓间充质干细胞抵抗氧化应激微环境的能力。

    另外，去铁胺还具有与其铁螯合作用无关的抗氧化应激能力。Davies等[23]认为，即使没有铁的存在，去铁胺也能与活性氧反应生成去铁胺硝基自由基。自那以后，人们已经确定去铁胺在淬灭烷氧基、过氧基、羟基和超氧化物自由基方面是有效的，并且当铁在反应体系中起作用时，这些效果还会增强[24]。

    三、去铁胺在脂肪移植领域的研究现状

    近年来，去铁胺除了在糖尿病创面愈合、骨再生、脊髓损伤修复、神经血管疾病治疗等方面被研究外[12,13,25]，也有学者开始研究去铁胺在自体脂肪移植中的作用，证明利用去铁胺特殊的药物作用，可以提高脂肪移植物的成活率。

    (一)去铁胺的给药方式

    在相关的研究中去铁胺一般有2种给药方式，一种方法是将去铁胺注射液直接注入脂肪移植物中，另一种是使用去铁胺对移植受体部位进行预处理。

    Temiz等[26]采用了第一种方式，在大鼠脂肪移植物中注入生理盐水、去铁胺或不注射任何液体，将处理后的脂肪植入大鼠肩胛旁区，术后第2个月取出移植物进行检查，结果显示，去铁胺组的活检标本的质量明显高于其他2组，其脂肪移植物存活率最高，然而去铁胺组炎症和纤维化发生率也明显高于其他组。有研究者认为，常驻基质细胞的成脂分化能力有助于脂肪移植物的长期保留[13,27]，而将去铁胺直接注射进脂肪移植物可能会导致细胞内铁缺乏，从而严重抑制脂肪细胞分化[28]。但采用去铁胺预处理受体部位的方式来提高脂肪移植物的存活率，仍有希望获得预期的结果。因此，更多的研究人员采用了该方法。

    Kim等[29]将分别含有25、50、100、200、400和600 μmol/L去铁胺的培养基作为体外实验组，将不含有去铁胺的培养基作为体外对照组，使用这些培养基分别培养人脐静脉内皮细胞进行体外实验；再以不对受区进行预处理的大鼠作为体内阴性对照组、300 μl生理盐水预处理受区的大鼠作为生理盐水组、300 μl生理盐水+去铁胺(100 mg/kg)预处理受区的大鼠作为体内实验组，预处理的方式为每隔1天在头皮下注射1次药物，共5次。结果表明，在体外实验中，100和200 μmol/L去铁胺组的人脐静脉内皮细胞存活率和成管能力都显著高于体外对照组和其他药物浓度的实验组。体内实验中，去铁胺也表现出了提高脂肪移植物存活率的能力，去铁胺预处理组的移植物体积、血流灌注、血管密度都显著高于体内阴性对照组和生理盐水组。同时，Kim等[29]对移植物中的脂周蛋白A(perilip A)进行了免疫荧光染色，脂周蛋白A是一种包裹脂肪细胞中脂滴的蛋白质，仅在存活的脂肪细胞中可检测到。在对脂周蛋白A阳性细胞数进行统计分析后，他们发现去铁胺组的阳性细胞数要明显高于阴性对照组和生理盐水组，认为去铁胺预处理可以显著提高脂肪移植物的存活率，同时不影响移植物的质量。Flacco等[30]也同样采用了预处理给药的方式，并取得了类似的结果。他们首先对小鼠的头皮进行放疗照射，然后随机将小鼠分为仅照射组、对照组和实验组，仅照射组不进行预处理，后2组分别使用生理盐水或去铁胺对头皮进行预处理，预处理方法为每隔1天在头皮真皮层下注射去铁胺(100 μl生理盐水中加入1 mg去铁胺)或单独注射100 μl生理盐水，共进行7次治疗，探究去铁胺预处理辐照组织能否改善血流灌注和脂肪移植物的保留。结果发现，去铁胺预处理可以通过增加受区血流灌注和血管密度促进脂肪移植物存活，并且未发现有明显的炎症和纤维化等移植物质量下降的表现。

    (二)去铁胺的药物浓度

    去铁胺在铁超载疾病中的应用已超过30年，即使在高剂量使用时，去铁胺对细胞的毒性作用也是有限的，因此研究人员认为可以通过调整去铁胺的剂量来取得最好的效果。

    在Flacco等[30]的实验研究中，事先对小鼠头皮进行放疗照射，获得类似于人类乳腺癌放射治疗后的辐照组织，随后每隔1天在小鼠头皮真皮下注射去铁胺溶液100 μl，共进行7次注射，其药物配比为1 mg去铁胺加100 μl生理盐水，该剂量是他们参考其他研究模型确定的[31,32,33]，尽管采用此剂量的去铁胺注入受照射部位后，脂肪移植物的长期存活情况得到了显著改善，但更高或更低的剂量、更少或更多的给药频次将导致血管生成增加或减少尚未可知。

    Kim等[29]对去铁胺药物浓度的选择更加谨慎，在人脐静脉内皮细胞体外实验中，他们使用0~600 μmol/L的去铁胺处理细胞，发现并不是药物浓度越高，细胞活力和细胞成管能力越强，MTT法结果表明去铁胺浓度≥400 μmol/L时在培养72 h后显著抑制人脐静脉内皮细胞的活力，当去铁胺浓度为100和200 μmol/L时，细胞活力和细胞成管能力高于其他组，表现为管长度和管数量增加，同时HIF-1α、可溶性生长因子-1α和VEGF的基因表达水平均有所提升。

    (三)去铁胺促进脂肪移植存活的机制

    移植脂肪中的血管形成是通过受体血管生长到移植物中，而不是通过供体来源的内皮细胞重组来实现[34]，这表明移植后脂肪移植物的存活在很大程度上取决于受体部位的血管环境，促进受体部位的血管形成可能会增加脂肪移植物的存活率。

    Flacco等[30]通过多普勒超声分析脂肪移植区域血流灌注、脂肪移植物质量和体积测定、受区皮肤组织学分析、CD31免疫组织化学染色等方法，对仅照射组、生理盐水处理组和去铁胺处理组的移植物和受区情况进行比较。结果表明，去铁胺预处理组受区血流灌注更丰富、血管密度更高，移植物的质量和体积也明显高于另外2组。他们认为，HIF-1α通常被脯氨酰羟化酶2 (prolyl hydroxylase 2，PHD2)降解，而去铁胺可以通过螯合具有PHD2活性的铁辅因子来稳定HIF-1α，可使下游血管生成因子和内皮祖细胞的募集增加。VEGF是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长的因子，具有促进血管内皮细胞增殖、迁移和血管形成等作用，这些作用有利于移植物早期血运的重建，因此当移植物植入去铁胺预处理的受区后，其存活率大大提高。

    Kim等[29]对受区部位和脂肪移植物中细胞因子的水平做了进一步分析。其中，对人脐静脉内皮细胞的体外实验显示，在去铁胺浓度为100和200 μmol/L时，与对照组相比，去铁胺显著增强了内皮细胞成管的能力，表现为管长度和管数量增加。在对细胞因子评估后他们发现，HIF-1α、SDF-1α和VEGF的基因水平均显著高于对照组。这与Flacco等[30]的结果类似，去铁胺通过上调HIF-1α的表达来促进下游VEGF、SDF-1α等细胞因子的表达，SDF-1α可以通过激活或调节特异性整合素分子来调节骨髓造血祖细胞的黏附和趋化性，从而在血管生成中发挥重要作用。最近，有研究发现在缺血组织中，SDF-1的过表达可以增强外周血内皮祖细胞的募集，并诱导新生血管形成[35,36,37]。

    为了验证去铁胺在体内实验中的作用，Kim等[29]对大鼠模型的头部皮肤进行了检查，但与预期相反，与对照组相比，去铁胺治疗没有显著增加皮肤血流灌注。其实验结果显示，在去铁胺组中观察到的新生毛细血管数量比对照组更多，然而各组间成熟毛细血管密度没有明显差异。同时，去铁胺组的VEGF蛋白水平升高，但HIF-1α和SDF-1α蛋白水平无明显变化。导致这一结果的原因可能是活检前的给药持续时间(第1次注射去铁胺后9 d)太短，无法观察到成熟血管的变化。Ram等[15]通过研究表明，对糖尿病创面愈合模型应用去铁胺治疗后14 d微血管密度最高。因此，随着时间的推移受区血管才可以通过增加毛细血管新生而得到增强。

    (四)可能存在的负面影响

    正如Temiz等[26]研究所显示的那样，若直接将去铁胺注射于脂肪移植物中进行移植，虽然去铁胺组活检标本的质量明显高于其他2组，但该组炎症和纤维化发生率也明显增高。这可能是因为去铁胺直接注射入脂肪中，其铁耗竭作用影响了常驻基质细胞的成脂分化，不利于脂肪移植物的长期保留[13,26,27]。相比于直接注射给药，采用去铁胺预处理受区的方式可减少这种负面作用。

    使用去铁胺预处理受区也有一些局限性，如果未来能够应用于临床，长时间多次注射去铁胺，会使患者感到不适、难以接受，限制了其临床使用范围。因此，我们应继续研究新的、更为有效的给药方式，比如开发透皮给药系统等新的方法，可以将去铁胺有效递送至起效部位，但是在目前的研究中该给药系统更多应用于糖尿病创面和缺血性皮瓣中[38,39,40]，是否能够通过该给药方式使药物确实有效地作用在自体脂肪移植的受区，也是一个值得研究的问题。

    另外，目前将去铁胺应用于自体脂肪移植的研究还不是很充分，去铁胺虽然已被证明可通过上调HIF-1α来增加新生血管的形成，但其应用于脂肪移植后对移植物后期质量的影响，以及移植物内新生血管是否能够呈良性生长的研究尚较少。

    四、去铁胺应用于脂肪移植领域的展望

    为了提高脂肪移植物的存活率，很多学者从脂肪移植术前、术中、术后3个方面进行了研究。其中，在术前可以对移植受区局部进行缺血缺氧预处理，提高受区VEGF的水平，促进血管再生[41]；还可以对受区预先应用细胞因子处理，促进移植部位早期血运的重建，减少术后脂肪移植物吸收，从而提高其成活率[42,43]。然而，通过将外源性物质如VEGF、表皮生长因子、促红细胞生成素对受区进行预处理，虽然提高了脂肪移植物的存活率，但仍然存在药物输送困难以及组织中血管瘤或肿瘤形成的问题[44,45]。但Kim等[29]和Flacco等[30]的实验研究未显示出在用去铁胺预处理受区后存在上述问题。

    自体脂肪移植可以用于肿瘤切除术后软组织缺损的修复，但有些患者术后需要行放疗，而辐射会产生活性氧，破坏细胞成分，导致非特异性炎症反应、过量的胶原沉积、邻近软组织的微血管闭塞，最终导致实质纤维化，因此在放疗部位进行自体脂肪移植仍具有挑战性。已有研究证明，去铁胺的抗氧化应激和促血管生成作用可以有效减少氧化损伤，降低真皮厚度和胶原含量，增加皮肤弹性，减少辐射引起的皮肤和组织纤维化[46,47,48]。同时，去铁胺应用于癌症术后的安全性也已有实验进行了证明，Lynn等[49]通过实验研究认为去铁胺不会增强乳腺癌细胞的生存能力，而是可以与放疗协同作用，抑制核因子-κB活化，诱导癌细胞凋亡，抑制其增殖。这表明去铁胺在乳腺癌术后自体脂肪移植再造乳房中具有很大的应用潜力。

    然而，如上文所述，使用去铁胺预处理操作时间长，患者比较痛苦不易接受，限制了其临床使用范围，因此新的给药方式仍然值得研究。另外，在去铁胺应用于脂肪移植领域的相关实验研究中，去铁胺促进脂肪移植物存活的信号通路尚未有详细的阐述。但在其他领域中，有学者对去铁胺相关信号通路进行过研究。Li等[50]报道去铁胺可能通过激活缺氧缺血后新生大鼠脑内Erk1/2 MAPK通路来上调HIF-1α。所以今后去铁胺应用于脂肪移植领域的研究也可以从这些方面入手，明确其作用机制。另外，目前去铁胺在脂肪移植领域中的研究主要集中于预处理过程中去铁胺促受区血管生成的效果上，而对于去铁胺的抗氧化应激和保护、激活干细胞的作用对脂肪移植物存活的影响还没有更深一步的研究，这也是我们应该继续探索的方向。

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参考文献

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第十二期内容

不同类型支架鼻整形术的回顾性研究

巨噬细胞在自体脂肪移植中作用机制的研究进展

脂肪移植研究现状及发展趋势文献计量学和可视化分析

自体脂肪移植致血管栓塞并发症的分析