两个遗传性并多指(趾)家系致病基因突变分析

两个遗传性并多指(趾)家系致病基因突变分析

季宝菊1 王伟2 姜良乾1 李琳1 赵向宇1 高春海1

本文来源：《中华整形外科杂志》2023年5月第39卷第5期

DOI:10. 3760 / cma.j.cn114453-20221019-00327

作者单位：1临沂市人民医院检验医学中心临沂市检验医学重点实验室，临沂276000；2临沂市人民医院骨科，临沂276000

通信作者：高春海，Email: gchunhai@126.com

引用本文

季宝菊, 王伟, 姜良乾, 等. 两个遗传性并多指(趾)家系致病基因突变分析 [J] . 中华整形外科杂志, 2023, 39(5) : 529-534. DOI: 10.3760/cma.j.cn114453-20221019-00327.

【摘要】

目的探讨2个并多指(趾)畸形(SPD)家系的致病基因。

方法收集2019年1月、2020年12月就诊于临沂市人民医院的2个SPD家系的临床资料，采集先证者及家系成员静脉血样本，提取基因组DNA，对先证者行全外显子组测序筛选候选基因变异；采用Sanger测序对2个家系成员验证其突变位点；采用生物信息学软件PolyPhen-2和PROVEAN对突变位点的致病性进行预测分析，结合美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)指南对突变位点进行致病性判断。

结果家系1三代成员中共有5例患者(男2例、女3例)，先证者为8岁女性，表现为右手第3、4指并指，指蹼融合和远端指甲融合，其余手指活动自如，双脚未见异常；家系2三代成员中共有4例患者(均为女性)，先证者为4岁女性，表现为双手第3、4指并指，示指侧弯。全外显子组测序分别在2个SPD家系中检出同源盒D13(HOXD13)基因c.917G>A和c.917G>T突变，且2个突变均呈现基因型-表型共分离，其中HOXD13基因c．917G>T突变未见数据库收录，为新发杂合错义突变。生物信息学软件预测这2个突变位点均为有害，结合ACMG指南，家系1 HOXD13基因c.917G>A突变的生物学致病等级符合PS1+PS4+PM1+PM2+PP3，可判断为致病突变；家系2的HOXD13基因c.917G>T突变符合PM2+PM5+PP3+PP4，可判断为疑似致病突变。

结论 HOXD13基因c.917G>A和c.917G>T突变是导致这2个SPD家系发病的原因。

【关键词】突变；并多指(趾)；同源盒D13基因；全外显子测序；遗传咨询

基金项目：山东省自然科学基金（ZR2020QH189，ZR2020QH047）

Genetic mutation analysis in two Chinese pedigrees affected with hereditary synpolydactyly

Ji Baoju1, Wang Wei2, Jiang Liangqian1, Li Lin1, Zhao Xiangyu1, Gao Chunhai1

1Department of Laboratory Medicine of Linyi People’s Hospital, Key Laboratory for Laboratory Medicine of Linyi City, Linyi 276000, China; 2Department of Orthopedic, Linyi People’s Hospital, Linyi 276000, China

Corresponding author: Gao Chunhai, Email: gchunhai@126.com

【Abstract】

Objective To investigate the pathogenic gene of the two pedigrees with hereditary synpolydactyly.

Methods Clinical data of two families admitted to the Linyi People’s Hospital due to hereditary synpolydactyly in January 2019 and December 2020 were recruited. Peripheral blood samples were collected and genomic DNAs were extracted. Whole exome sequencing was conducted to detect the pathological mutations and Sanger sequencing was used to verify the variants. The pathogenicity of the mutations was predicted according to PolyPhen-2, PROVEAN and the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) guidelines.

Results There were a total of 5 patients (2 males and 3 females) in family 1. The proband was an 8-year-old girl, showed syndactyly of the third and fourth fingers of the right hand with webbed fusion and distal fingernail fusion. The rest of the fingers and feet were normal. There were a total of 4 patients (all females) in family 2. The proband was a 4-year-old girl, and showed the interlocking of the third and fourth fingers on both hands and the lateral curvature of the indicator finger. Two mutations of the homeobox D13(HOXD13) gene, c. 917G>A and c. 917G>T were detected and co-segregated with the disease phenotype in two affected families. Moreover, the variant of c. 917G>T is a novel missense mutation of the HOXD13 gene. According to ACMG guidelines, c. 917G>A meets the criteria of pathogenic variation (PS1+ PS4+ PM1+ PM2+ PP3) and c. 917G>T meets the criteria of likely pathogenic variation (PM2+ PM5+ PP3+ PP4).

Conclusion The HOXD13 gene c. 917G>A and c. 917G>T mutations are identified to be responsible for hereditary synpolydactyly in these two families.

【Key words】Mutation; Synpolydactyly; Homeobox D13 gene; Whole exome sequencing; Genetic consulting

Fund program: Shandong Province Fund of Natural Research (ZR2020QH189, ZR2020QH047)

Disclosure of Conflicts of Interest: The authors have no financial interest to declare in relation to the content of this article.

Ethical Approval: Ethical approval was given by the Medical Ethics Committee of the Linyi People’s Hospital（YX200082）.

并多指(趾)畸形(synpolydactyly，SPD)是一种以肢端发育异常为主要临床表型的遗传性疾病，通常呈常染色体显性遗传。同源盒D13(homeobox D13，HOXD13)基因定位于2q31.1，含2个外显子，在肢体早期发育过程中起关键调控作用[1,2,3,4]。相关研究表明，HOXD13基因的多聚丙氨酸链延展突变、移码突变和错义突变都可引起SPD表型[5,6,7,8,9]。随着高通量测序技术的发展，外显子测序在遗传性骨骼畸形的分子诊断中呈现出显著优势。在本研究中，我们通过全外显子组测序为2个遗传性SPD家系寻找致病变异，为患病家系的遗传咨询和再生育指导提供实验诊断依据。

对象与方法

一、研究对象

以2019年1月、2020年12月就诊于临沂市人民医院的2个遗传性SPD家系为研究对象。本研究经临沂市人民医院伦理委员会批准(YX200082)，先证者及其亲属对本研究知情，并签署了知情同意书。

二、研究方法

(一)样本采集

对2个SPD家系患者进行体格检查，获得先证者及其亲属知情同意后，采集先证者及部分家系成员外周静脉血各2 ml，于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中保存。

(二)DNA提取

采用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒(德国Qiagen公司)提取外周血基因组DNA，以紫外分光光度计进行浓度检测，琼脂糖凝胶电泳进行DNA样本完整性检测，全部DNA样品质量符合标准，于－20 ℃冰箱冷冻保存。

(三)全外显子组测序

对2个SPD家系中的先证者进行全外显子测序分析。通过XGen®Exome Research Panel V1.0捕获试剂盒构建测序文库(美国Integrated DNA Technologies公司)；使用Illumina novaseq 6000(美国Illumina公司)平台进行测序；采用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)序列比对软件(https：//bio-bwa.sourceforge.net/) 将测序数据与参考基因组GRCh37/hg19 (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/grc/human)进行比对；使用GATK软件(https：//software.broadinstitute.org/gatk/download/)分析单核苷酸多态性、插入缺失；使用外显子组整合数据库(http：//gnomad-sg.org/)过滤筛选等位基因频率<1%的突变位点，过滤同义突变和正常对照人群携带的常见突变，对候选基因相关突变进行筛选。

(四)Sanger测序

针对检出的HOXD13基因c.917G>A和c.917G>T突变位点，通过Primer Premier 5.0软件设计聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增引物，引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，正向引物：5′-G G T G C T C C G A A T A T C C C A G C CT-3′，反向引物：5′-T G G C C A A C C T G G A C C A C A T C AG-3′。采用PCR扩增SPD家系成员目的DNA片段，95 ℃预变性1 min，98 ℃变性5 s，58 ℃退火5 s，72 ℃延伸1 min，循环30次，72 ℃终延伸2 min，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定，纯化后进行Sanger正、反向测序。

(五)候选基因突变位点致病性分析

将Sanger测序结果与UCSC数据库(http：//genome.ucsc.edu/)人类基因组参考序列比对，进行家系基因型-表型共分离分析；采用PolyPhen-2(http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml)和PROVEAN软件(https：//www.jcvi.org/research/provean)对突变位点的致病性进行预测分析。PolyPhen-2预测值在0.909~1之间为可能有害(probably damaging，PD)，PROVEAN预测值在－14~－2.5之间为有害(deleterious，D)；使用ClustalW2软件(https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)分析氨基酸在不同物种中的保守性；根据美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)遗传变异分类标准与指南对突变位点的致病性进行评估[10]。

结果

一、家系临床特征(图1，图2)

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