甲基丙烯酰明胶负载脂肪来源间充质干细胞条件培养基促进老年皮肤创面愈合

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    皮肤衰老导致创面愈合缓慢甚至不愈合，且现有治疗手段无法达到令人满意的效果。脂肪来源间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)因其强大的细胞因子释放能力，近年来成为再生医学的研究热点，ADSCs来源的条件培养基(ADSCs conditioned medium，ADSCs-CM)被认为含有多种细胞因子，在治疗皮肤缺损方面被证实有效，但常规的ADSCs-CM收集手段难以富集高浓度的细胞因子，且在创缘、创基注射的给药方式使其难以在创面留存。为了解决这些问题，本研究通过低氧预处理和物理浓缩的方式得到了含有高浓度细胞因子的浓缩ADSCs-CM(hypo-CM)，并选用了一种可注射、可光固化、可缓释且有一定黏度和机械性能的水凝胶材料——甲基丙烯酰明胶(gelatin methacryloyl，GelMA)，负载hypo-CM，以达到在创面缓释细胞因子的效果。本研究为探索老年难愈性创面的治疗及机制提供了新的方向。

    本研究首先在老年和年轻的C57BL/6J小鼠背部建立全层皮肤缺损创面，结果发现老年组创面愈合延迟，且存在皮肤血运重建障碍，这与临床现象一致。同时，收集人脂肪组织标本，提取并培养原代ADSCs，在2%氧浓度的条件下预处理ADSCs 48 h后收集条件培养基，通过物理离心的方法得到hypo-CM，应用Luminex液相芯片检测后发现，相较于常氧培养，包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在内的40余种细胞因子的浓度在低氧预处理后明显升高，并且以蛋白质印迹法证实了这种作用与缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)信号通路密切相关。应用hypo-CM可以在体外促进血管内皮细胞的增殖、迁移和成管，而且可以激活血管内皮细胞的VEGF/AKT/mTOR和MAPK信号通路。随后，制备了不同浓度的负载hypo－CM的GelMA(hypo-CM+GelMA)，通过电镜、缓释测试、应力-应变实验、流变测试等鉴定了它们的物理性能，发现10% GelMA与hypo-CM以1∶1配比得到的水凝胶，具有最适合在皮肤创面应用的物理性状，并进行了后续的体内实验。在体内实验中发现hypo-CM+GelMA可以显著地促进老年小鼠皮肤创面的愈合，并且促进创面血运的恢复，这印证了体外实验的结果，说明hypo-CM+GelMA是一种治疗老年皮肤创面的有效手段(图1)。

    人口老龄化是全球人口年龄组成的现实。伴随着衰老，各种组织和器官的损伤修复能力下降，老化皮肤易损伤、难愈合，临床上高龄患者常因褥疮、糖尿病足等难愈性创面而严重影响生存质量，甚至死亡。ADSCs及其衍生物的相关研究是难愈性创面的治疗热点和研究方向。目前，临床上对于ADSCs的应用基本局限于创面表面涂抹换药，或在创缘基底局部注射，难以保证ADSCs的效价及持续作用效果。如何提升ADSCs旁分泌细胞因子的能力，以及ADSCs及其衍生物在治疗部位的留存率，是困扰学术界的难题。本研究提出，一方面利用低氧预处理和物理浓缩的方式得到含有更高浓度细胞因子的hypo-CM，另一方面选用了一种生物相容性好的新型材料作为hypo-CM载体，可以保证细胞因子在创面的缓释及持续分泌，极大地提高了治疗效率，弥补了以往临床应用ADSCs的技术难题。

    本研究为皮肤软组织创面治疗的基础研究提供了新的角度：联合再生医学和材料学初步探索ADSCs治疗皮肤软组织难愈性创面的可行性，为该治疗的临床转化奠定了实验基础。

    值得一提的是，在研究设计方面，本研究循序渐进，首先发现临床问题，继而通过动物实验验证，再针对性地提出解决方案并验证其有效性，最后发掘潜在机制，论证逻辑具有很强的层次感和缜密性。这种研究设计方法不仅科学严谨，而且方便广大读者理解研究的内容。在论文撰写方面，我们围绕核心的学术问题展开论证，用一种"讲故事"的方法，从发现临床问题开始论述，按照与研究设计相同的顺序，很好地将碎片化的结果整合起来。但是，本研究也具有一定的局限性。首先，创面愈合是有多种细胞参与的复杂过程，在本研究机制验证部分只选取了人血管内皮细胞进行实验，并未验证包括表皮细胞、成纤维细胞在内的其他细胞对hypo-CM+GelMA的反应。其次，本研究并未涉及GelMA与人血管内皮细胞的三维培养，无法明确细胞在空间中的形态和生物学行为变化。

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