单细胞测序数据分析瘢痕疙瘩和局限性硬皮病组织中周细胞的差异

单细胞测序数据分析瘢痕疙瘩和局限性硬皮病组织中周细胞的差异

孔宇祥1,2 李志帅1,2 傅歆1,2 严笠1,2 肖苒1,2

本文来源：《中华整形外科杂志》2023年6月第39卷第6期

DOI:10. 3760 / cma.j.cn114453-20230321-00060

作者单位：1中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院研究中心，北京100144；2中国医学科学院体表组织器官再造研究重点实验室，北京100144

通信作者：肖苒，Email：xiaoran@psh.pumc.edu.cn；严笠，Email：yanli@psh.pumc.edu.cn

引用本文

孔宇祥, 李志帅, 傅歆, 等. 单细胞测序数据分析瘢痕疙瘩和局限性硬皮病组织中周细胞的差异 [J] . 中华整形外科杂志, 2023, 39(6) : 602-609. DOI: 10.3760/cma.j.cn114453-20230321-00060.

【摘要】

目的探讨瘢痕疙瘩和局限性硬皮病组织中周细胞的异质性及其演化轨迹差异，为研究2种皮肤纤维化疾病的致病机制和治疗靶点提供新的线索。

方法选取GEO和GSA-Human数据库中的3例局限性硬皮病、4例瘢痕疙瘩及其对应的邻近正常皮肤样本细胞的单细胞转录组测序数据，绘制数据的表达矩阵。采用R语言的Seurat 4.3.0包进行处理后分群绘制t-SNE可视化图谱。采用Monocle 2.24.0包对其中的周细胞进行拟时序轨迹分析。

结果瘢痕疙瘩和局限性硬皮病皮肤组织无监督聚类为19个不同的细胞群体，其中周细胞为C7、C11群，高表达PDGFRB和RGS5基因，占总细胞数的7.53%。周细胞进一步可分为8个亚群，拟时序分析发现基因表达变化主要有细胞命运1(fate 1)和细胞命运2(fate 2)2个分支轨迹，依照时序周细胞可分为5个状态(S1~S5);其中S4占前分支的绝大部分，代表最初状态的周细胞；S5构成细胞命运1分支的大部分，代表分化较早期状态的周细胞；S1、S2、S3构成命运2分支的大部分，其中S3代表分化中期状态的周细胞，而S1、S2则代表分化晚期状态的周细胞。在正常皮肤中，各分化状态的周细胞均匀分布，而瘢痕疙瘩周细胞主要分布于前支(S4)、分支1(S5)及分支2中的前一部分(S3)，分别代表初始、早期及分化中期的细胞状态，分支基因表达动态分析显示其高表达SOX4、COL4A1、COL6A3、AHR、CXCL3和IL1R1等基因；而局限性硬皮病的周细胞主要分布于分支2的中后部分(S1、S2)，代表分化末期的细胞，高表达ACTA2和MYH11等基因。

结论瘢痕疙瘩和局限性硬皮病中周细胞具有异质性以及不同的演化轨迹；瘢痕疙瘩周细胞更具有干细胞样特性，通过高表达与细胞干性、上皮-间质转换、侵袭性和免疫微环境调控相关的基因，对其侵袭性和复发的病理特性发挥重要作用；而局限性硬皮病中周细胞可能主要转分化为肌成纤维细胞，导致其纤维化病理表型。

【关键词】瘢痕疙瘩；局限性硬皮病；周细胞；单细胞RNA测序；拟时序分析

基金项目：中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目（2021-I2M-1-052）；中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院院所基金（YS202018）

Single-cell RNA-sequencing analysis of differences in pericytes in keloid and localized scleroderma tissues

Kong Yuxiang1,2, Li Zhishuai1,2, Fu Xin1,2, Yan Li1,2, Xiao Ran1,2

1Research Center of Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100144, China; 2Key Laboratory of External Tissue and Organ Regeneration, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100144, China

Corresponding author: Xiao Ran, Email: xiaoran@psh.pumc.edu.cn; Yan Li, Email: yanli@psh.pumc.edu.cn

【Abstract】

Objective To explore the cellular heterogeneity and the differences in branched trajectory of pericytes between keloids and localized scleroderma, and to provide new clues for the pathogenesis and therapeutic targets of the two skin fibrotic diseases.

Methods Single cell transcriptome sequencing (scRNA-seq) data of 3 cases of scleroderma, 4 cases of keloid and their corresponding 4 cases of adjacent normal skin samples were selected from GEO and GSA-Human databases, and the expression matrix of the data was drawn. Seurat 4.3.0 of R (4.2.2) was used to process the t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) visualization map. Monocle 2.24.0 was used to analyze the pseudo-temporal trajectory of pericytes.

Results The unsupervised clustering of keloid and scleroderma skin tissues revealed 19 different cell populations, among which C7 and C11 cells were pericytes, marked by high expression levels of PDGFRB and RGS5 genes, accounting for 7.53% of the total cells. Pericytes can be further divided into 8 subgroups. Pseudo-temporal analysis revealed a branched trajectory with two major branches, that is, cell fate 1 and cell fate 2, which could be further divided into 5 cellular states of pericytes (S1-S5). S4 constituted the most of the prebranch, which represented the cellular state of the initial pericyte phenotype. S5 constituted the most of the cell fate 1 branch, which represented the early differentiation state of the pericyte phenotype. S1, S2, S3 constituted the most of the cell fate 2 branch. S3 represented the intermediate differentiation state of the pericyte phenotype, while S1 and S2 represented the terminal differentiation states of the pericyte phenotype. Compared with the uniform distribution of various differentiation states of pericytes in normal skin, the keloid pericytes mainly distributed in the prebranch (S4), cell fate 1 (S5) and the first half of cell fate 2 (S3), representing cellular states of the initial, early and intermediate phases of the pericyte phenotype. Branched expression analysis modeling revealed the overexpression of SOX4, COL4A1, COL6A3, AHR, CXCL3 and IL1R1 genes, et cetera. On the other hand, the localized scleroderma pericytes mainly distributed in the bottom half of cell fate 2 (S1, S2), representing the final differentiated phase of pericyte phenotype, which overexpressed ACTA2 and MYH11 genes.

Conclusion Pericytes in keloid and scleroderma are heterogenous and have different differentiation trajectories. Pericytes in keloid have stem-like characteristics, and play an important role in the pathologic characteristics of invasiveness and recurrence through high expression of genes related to cell stemness, epithelial-mesenchymal transition, invasiveness, and immune microenvironment regulation. However, pericytes in localized scleroderma may mainly transdifferentiate into myofibroblasts, leading to their fibrotic pathological phenotype.

【Key words】Keloid; Localized scleroderma; Pericyte; Single-cell RNA-sequencing; Pseudo-time analysis

Fund program: CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2021-I2M-1-052); Special Research Fund for Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College (YS202018)

Disclosure of Conflicts of Interest: The authors have no financial interest to declare in relation to the content of this article.

瘢痕疙瘩与硬皮病均属于皮肤纤维化疾病，表现为皮肤组织中细胞外基质的过度沉积，并伴随炎症反应和微血管形成及功能障碍，多种间质细胞均参与其病理过程，其中成纤维细胞是主要的功能细胞，在炎症等因素刺激下可以分化成肌成纤维细胞，分泌胶原等细胞外基质[1]，而周细胞增多则可以通过转分化为肌成纤维细胞或造成微血管堵塞等机制发挥致病作用[2,3]。硬皮病和瘢痕疙瘩在临床上需要加以鉴别诊断[4]，且目前由于病因和发病机制尚不完全清楚，2种疾病均缺乏安全精准的根治方法。既往的文献报道认为微血管病变是硬皮病的致病机制，而周细胞与硬皮病等多种疾病的微血管病变有关[5]。与正常皮肤相比，瘢痕疙瘩中微血管被更多周细胞包绕，类似肌成纤维细胞，可以从血管周围迁移到间质，低氧条件下周细胞收缩可以加重血管腔的堵塞，导致不断增加的低氧和纤维增殖[6]。但有关周细胞在瘢痕疙瘩和硬皮病中的异质性及其不同亚群分化过程中的动态调节差异鲜见报道。近年来，随着单细胞测序技术的应用，细胞异质性及其在疾病发生发展中的基因表达演化轨迹已成为研究热点。本研究选取了公共数据库中正常皮肤组织、瘢痕疙瘩组织与局限性硬皮病组织中单细胞转录组测序(single－cell RNA－sequencing, scRNA-seq)数据，构建了转录组图谱，详细描述了瘢痕疙瘩与局限性硬皮病组织中周细胞不同亚群的拟时序分析结果，比较了2种疾病中周细胞亚群的分化和发展轨迹，为揭示周细胞异质性及其不同亚群分化过程中基因功能的变化对不同皮肤纤维性疾病的调控机制提供了新的线索。

资料与方法

一、资料来源

在本研究中，共分析了3例局限性硬皮病、4例瘢痕疙瘩和4例瘢痕疙瘩组织对应的邻近皮肤样本的scRNA-seq数据。硬皮病组织的scRNA-seq数据来源是由Mirizio等[7]上传至NCBI’s Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中，编号为GSE160536。4例瘢痕疙瘩和其对应的邻近皮肤scRNA-seq数据来源是由Liu等[8]上传至人类遗传资源组学原始数据归档库(GSA-Human)数据库中，编号为PRJCA003143，均为皮肤全层解离获取的细胞样本。

二、方法

(一)数据转换

使用fasterq-dump软件(sratoolkit 3.0.2，NCBI，USA)对下载的scRNA-seq数据进行格式转换，Cell Ranger软件(10X Genomics CellRanger 7.1.0，Pleasonton，CA，USA)[9]进行定量，绘制单细胞转录组数据的表达矩阵。

(二)载入矩阵和细胞过滤

将所获得的表达矩阵整合为一个新的数据集，将数据集导入R语言(4.2.2)，用Seurat 4.3.0包对数据集做进一步处理，数据质控去除表达基因小于200个的细胞和少于3个细胞表达的基因，然后选取少于20 000个细胞表达的基因，表达基因数目小于4 000个且线粒体基因少于15种的细胞。

(三)归一化及降维分群

采用Scale法对数据归一化，将细胞间每个基因的表达转换为Z分数(值以0为中心，方差为1)，在下游分析时每个基因具有同等的权重，这样高表达基因就不会占主导地位。归一化后进行主成分分析(principal component analysis，PCA)降维后进行无监督聚类分群并绘制t-SNE(t-distributed stochastic neighbor embedding)可视化图谱。

(四)差异基因与细胞注释

选取每个群与其他群差异最大的3个特征基因绘制热图，参考文献的特征基因，依照每种细胞特征基因的高表达细胞亚群，对细胞进行注释。

(五)周细胞亚群的再分群与拟时序分析

选取注释后的周细胞亚群，重新进行降维聚类分群后，采用Monocle 2.24.0包进行拟时序轨迹分析。使用Beam(branched expression analysis modeling)指令以分支点为中心，以多检验矫正(multiple-testing correction)得到的q值(P-adjusted)小于0.001为标准，寻找不同分支的差异基因绘制热图，选取其中每个模块的部分代表性的基因绘制拟时序轨迹图。

结　果

一、单细胞测序数据分析提示瘢痕疙瘩和局限性硬皮病皮肤组织中细胞的多样性

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