脂肪干细胞来源的外泌体对局限性硬皮病成纤维细胞生物学功能的影响

    硬皮病是一种病因不明的自身免疫性纤维化疾病，有2种不同的临床分型：系统性硬化症(systemic scleredema)和局限性硬皮病(localized scleroderma，也称morphea)。局限性硬皮病会出现皮肤硬化、皮下脂肪萎缩、局部凹陷等表现，常常需要在整形外科治疗[1]。自体脂肪移植具有手术创伤小、来源广、无排斥反应、可重复注射、填充效果好等优点，因而成为目前治疗局限性硬皮病引起的面部凹陷畸形最常用的手术方法，尤其是轻中度的局限性硬皮病患者尤其适用[2,3]。同时，在临床及基础研究中人们逐渐发现了应用脂肪干细胞(adipose－derived stem cells，ADSC)治疗硬皮病的可能。ADSC能够明显提高移植脂肪存活率，改善局部组织的血供，具有免疫调节作用，同时ADSC能显著降低Ⅰ型胶原等纤维化指标的表达，抑制成纤维细胞增殖[4,5,6,7,8]。ADSC的抗纤维化特性归功于其旁分泌机制，正是脂肪干细胞来源的外泌体(ADSC-derived exosomes，ADSC-Exo)主要介导了这一过程。外泌体是一种运输载体系统，用于在供体细胞和受体细胞之间进行通信并传递物质信息(mRNA、miRNA、蛋白质和脂质)[9]。据报道，间充质干细胞来源的外泌体可以抑制系统性硬化症小鼠模型的纤维化[10,11]。然而，很少有人注意到ADSC-Exo在局限性硬皮病中的作用，其机制也尚未完全了解。转化生长因子(transforming growth factor，TGF)是调节纤维化过程的关键信号分子，更有研究提到硬皮病的纤维化主要受TGF-β/Smad信号通路的调控[12]。因此，在本研究中，我们收集局限性硬皮病患者患处的皮肤，提取成纤维细胞，即局限性硬皮病成纤维细胞(localized scleroderma fibroblasts, LSFs)，并收集健康人的ADSC-Exo，经系列体外实验，探索ADSC-Exo是否能够通过TGF-β/Smad信号通路抑制LSFs纤维化标志的表达。

材料与方法

     一、标本来源

    硬皮病皮肤标本来自2021年1月至2022年1月北京协和医院整形外科15例患者的手术切除标本，其中男7例，女8例，年龄(28.4±6.7)岁(19~38岁)。健康脂肪标本来自2021年1月至2022年1月北京协和医院整形外科10例腹部吸脂患者的手术剩余标本，男5例，女5例，年龄(31.5±4.7)岁(25~37)岁。

    患者纳入标准：年龄18~49岁；诊断为局限性硬皮病，病灶位于面部；既往未曾接受过脂肪移植手术治疗、未曾使用糖皮质激素治疗。健康人纳入标准：年龄18~49岁，身体健康；拟行腹部或大腿脂肪抽吸术，同意将其脂肪组织作为研究标本来源。排除标准：有血液系统、神经系统、免疫系统疾病，凝血功能障碍，有精神疾病等病史；有手术禁忌证；未签署知情同意书。本研究经北京协和医院伦理审查委员会批准(JS-3469)，患者对本研究知情且同意，并签署知情同意书。

     二、实验试剂与仪器

    DMEM/F12培养液、胎牛血清、Ⅰ型胶原酶(美国Gibco公司)，中性鞘磷脂酶抑制剂GW4869(上海翌圣生物科技股份有限公司)，Transwell小室(美国Beckman Coulter公司)，CCK-8试剂盒、BCA蛋白测定试剂盒、PAGE凝胶制备试剂盒、RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白Marker、ECL化学发光检测试剂盒(广州碧云天公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore公司)，TGF-β冻干粉(美国Peprotech公司)，兔抗人Ⅰ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)、p-Smad2/3、TGF-β、TGF-β受体1(TGF-β receptor 1, TGF-βR1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的抗体，以及辣根过氧化物酶和荧光标记的山羊抗兔IgG抗体(英国Abcam公司)，鬼笔环肽ActinGreen™ 488 ReadyProbes™(美国Invitrogen公司)，PKH26(上海宇玫博生物科技有限公司)，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)、磷酸氢二钠、Tween-20(中国国药集团化学试剂有限公司)，荧光定量PCR试剂盒(染料法)、MightyScript第一链cDNA合成试剂盒、嘌呤霉素盐酸盐(上海生工生物公司)，聚醚砜膜过滤器(美国Corning公司)，超速离心机(美国Beckman Coulter公司)，透射电子显微镜(美国Thermo Scientific公司)，纳米颗粒跟踪分析系统(德国ParticleMetrix公司，型号ZetaView®),化学发光成像仪(上海天能生命科学有限公司，型号Tanon 4200SF )。

     三、实验方法

     (一)成纤维细胞分离与培养

    在无菌条件下去除局限性硬皮病患者皮肤组织的表皮及脂肪，用含100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素的PBS溶液漂洗3次，剪切为大小约1 mm3的小块，接种于胎牛血清湿润过的T25培养瓶中，加入5 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液，置于含5% CO2细胞培养箱中倒置培养过夜，第2天翻转培养瓶。培养7 d后观察成纤维细胞萌出情况并更换培养基，之后每3天更换1次培养基。待培养瓶底的细胞覆盖率达到80%~90%时，进行传代，将第2代的细胞分为对照组(PBS溶液)、EXO组(20 μg/ml ADSC-Exo)、TGF-β组(10 ng/ml TGF-β)、TGF-β+EXO组(10 ng/ml TGF-β+20 μg/ml ADSC-Exo)，分别加入等量对应溶液后继续培养传代，取第3~10代细胞进行后续实验。

    (二)ADSC的分离、培养与鉴定

    取吸脂术采集的脂肪组织，加入等体积PBS溶液，反复混匀后离心(300× g)；取上层的脂肪加入0.2%的Ⅰ型胶原酶，在37 ℃下摇床消化30 min ；用100 μm筛网过滤除去未消化的组织；加入适量的PBS溶液，混匀后离心(300× g)；同法重复3次，弃去上清液，将沉淀的细胞重悬于含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基中，接种至细胞培养瓶中；在37 ℃含有5% CO2细胞培养箱内培养；48 h后弃未贴壁的细胞，每3天换液1次，待培养瓶底的细胞覆盖率达到80%~90%时进行传代，取第3~10代细胞进行后续实验。对于ADSC的鉴定，将ADSC铺种在预涂有0.1%明胶溶液的6孔板中，分别用成脂、成骨分化诱导培养基孵育ADSC 1、3周。以4%多聚甲醛固定，并用油红O和茜素红染色，检测诱导培养的结果，在光学显微镜下观察。

    (三)ADSC-Exo的提取与鉴定

    待第3~5代ADSC的培养瓶细胞覆盖率达80%~90%时，收集培养上清液并以2 000×g离心10 min。取上清经0.1 mm孔径的聚醚砜膜过滤器过滤，去除细胞碎片和大泡囊。然后使用70 Ti的转子将上清液以100 000× g在4 ℃下超速离心1 h。将所得颗粒沉淀再重悬于6 ml PBS中，并使用100 Ti转子以100 000× g在4 ℃下超离心1 h。通过透射电子显微镜立即观察分离的ADSC-Exo的形态，并通过纳米颗粒跟踪分析系统分析其粒径分布。同时，以BCA法进行外泌体蛋白定量，进行蛋白质印迹以检测ADSC-Exo标志物(CD63、CD81、TSG101、钙连蛋白)的表达。接下来检验ADSC-Exo是否可以内化在LSFs中。向ADSC-Exo中加入PKH26染色工作液，充分混匀后静置孵育10 min。120 000× g离心90 min除去游离的工作液，将ADSC-Exo与LSFs共孵育12 h。弃上清，PBS洗细胞3次，4%多聚甲醛固定15 min，用0.2% Triton X-100孵育样品10 min破膜，加入鬼笔环肽显示细胞的微丝骨架，37 ℃避光孵育30 min ；弃鬼笔环肽工作液，用PBS避光洗涤细胞3~5次；用Hoechst 33342染细胞核，指甲油封片；激光共聚焦显微镜下拍照。

    (四)细胞外囊泡分泌抑制实验检测ADSC-Exo对LSFs纤维化标志物表达的影响

    将1×105个LSFs置于6孔板中，为便于后续的细胞分离，将1×105个ADSC置于Transwell小室(小室底部有0.4 μm孔径的聚碳酸酯膜)中共培养，同时加或不加20 μmol/L细胞外囊泡抑制剂GW4869(ADSC+GW4869组或ADSC组)；并设未经ADSC干预的对照组，于Transwell小室中加入等量的PBS代替ADSC细胞悬液，同时加或不加20 μmol/L GW4869(PBS组或PBS+GW4869组)。在48 h后收集LSFs，使用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)检测Ⅰ型胶原(collagen Ⅰ，Col1)、Ⅲ型胶原(collagen Ⅲ，Col3)、α-SMA的mRNA表达量。

     (五)CCK-8法检测ADSC-Exo对LSFs增殖能力的影响

    将处于对数生长期EXO组和对照组LSFs进行胰蛋白酶消化，将细胞浓度调整为1×105 /ml。在96孔板中每孔加入1×104个细胞，每组设3个复孔。待细胞贴壁后，分别于培养第0、1、2、3、4、5天共6个时间点检测LSFs增殖情况。检测时每孔加入90 μl培养液和10 μl CCK-8溶液，在培养箱内继续孵育4 h后，于酶标仪上读取450 nm波长的吸光度并计算细胞增殖率。

     (六)划痕实验检测ADSC-Exo对LSFs迁移能力的影响

    将处于对数生长期EXO组和对照组LSFs进行胰蛋白酶消化，于6孔板中每孔加入约5×105个细胞。第2天用加样枪头在细胞层上进行划痕。划痕完成后，使用无菌PBS洗细胞3次，更换无血清培养基。将细胞放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养。0、12、24 h在显微镜下观察拍照并测量划痕的宽度，计算细胞迁移率。

     (七)qRT-PCR

    以Trizol法抽提LSFs总RNA，逆转录合成cDNA，以qRT-PCR检测各纤维化指标(Col1、Col3、α-SMA和TGF-β)的mRNA表达水平。按照染料法qRT-PCR试剂盒说明制备PCR反应体系，反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s，40个循环。采用2－△△Ct法计算mRNA相对表达量。引物序列见表1。

    (八)蛋白质印迹法

    用胰蛋白酶消化对照组、EXO组、TGF-β组、TGF-β+EXO组的LSFs，收集后用PBS洗涤2次，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液冰上孵育30 min,提取细胞蛋白。通过BCA试剂盒测定蛋白质浓度。于10% SDS-PAGE凝胶各加样孔中加入50 μg总蛋白，电泳分离后，在100 V电压下转移至PVDF膜，转膜过程约100 min 。在室温下，于5%脱脂牛奶中封闭2 h，加入兔抗人一抗(Col1、α-SMA、p-Smad2/3、TGF-β和GAPDH)在4℃过夜。第2天，将PVDF膜和山羊抗兔IgG二抗在37℃下孵育1 h 。使用ECL试剂盒在化学发光成像仪上观察膜上的免疫反应印迹，以GAPDH为内参，采用Image J软件(美国国立卫生研究院)分析蛋白表达强度。目的蛋白相对表达量＝目的蛋白的灰度值/内参蛋白的灰度值。

    (九)免疫荧光检测

    将EXO组和对照组LSFs进行胰蛋白酶消化，于6孔板中每孔中加入约5×105个细胞。在室温下用4%多聚甲醛固定30 min 。细胞用PBS洗涤3次，检测α-SMA的组还需使用0.1%Triton X-100通透30 min，并在PBS中用3%牛血清白蛋白封闭1 h 。加入兔抗人一抗(α-SMA和TGF-βR1)，在4 ℃下孵育过夜。第2天，加入羊抗兔IgG二抗在37℃下孵育1 h，并用DAPI复染，通过共聚焦显微镜观察，使用Image J软件分析荧光强度。

    四、统计学处理

    采用SPSS17.0软件进行数据分析。每个实验至少重复3次。2组比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结　果

     一、ADSC和ADSC-Exo的鉴定

    ......

第十四期内容

乳房再造手术时机、分期名词规范和双血管蒂腹壁

下动脉穿支皮瓣乳房再造

单细胞测序数据分析瘢痕疙瘩和局限性硬皮病组织中周细胞的差异

人脂肪来源间充质干细胞条件培养基对病理性瘢痕成纤维细胞生物学行为的影响

脂肪间充质干细胞在抑制博来霉素诱导裸鼠皮肤纤维化方面的作用