黑色素瘤靶点及其靶向治疗药物

    在全球多数肿瘤发病率不断下降的同时，恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)发病率却逐年升高[1]，是整形外科致死率最高的皮肤软组织肿瘤[2]。在西方国家，MM主要危险因素是日晒，发病率较高[3]；在我国，MM多见于肢端，摩擦和压力为主要致病因素[4]，虽然发病率低于西方国家，但人口基数大，总发病人数并不少[5]。MM的治疗早期主要通过外科手术，不宜切除的转移性MM依赖免疫治疗、靶向治疗、化疗等改善预后[6]。近年来，MM靶向治疗发展迅速，但一线靶向药物单药总体客观缓解率(objective response rate，ORR)在20%左右[7]。本文阐述了MM治疗的潜在靶点和具有潜力的药物的临床试验，旨在帮助临床医生更好地了解该疾病靶向治疗的前景，发现更多有效的治疗药物。

     一、MM概述及治疗

    MM是来源于黑素细胞的软组织恶性肿瘤，发病率逐年上升，我国每年有2万以上患者发病[1,8]。由黑色素痣发展的MM临床表现为黑痣形状不规则、边界模糊、瘙痒破溃、颜色不均，并出现卫星灶，远处转移症状等[9]。MM恶性程度高，转移较早，国内很多医院尤其是在三甲医院整形外科就诊的患者临床确诊时多为Ⅲ、Ⅳ期。

    Ⅰ、Ⅱ期皮肤型MM主要依靠外科手术治疗，5年生存率较高。ⅡB期以上需要辅助治疗，首选免疫治疗，存在B-Raf原癌基因(B-Raf proto-oncogene，BRAF)突变的患者可以考虑BRAF/丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)抑制剂联合的靶向治疗[6]。溶瘤病毒注射可用于局部病变，如皮肤、皮下组织和淋巴结病变等；对于非皮肤型MM，如葡萄膜MM暂无具体的治疗建议；转移性黏膜MM的治疗可以参考皮肤型MM，也可以考虑联合使用化疗药物或联合抗肿瘤血管药物治疗[10]。

    随着个体化医疗的发展，靶向治疗和免疫治疗因具有更明显的肿瘤应答和更小的临床不良反应，越来越受欢迎。靶向治疗是通过药物阻断调控肿瘤恶性表型的关键信号蛋白(往往是突变基因)，诱导肿瘤细胞凋亡而抑制其进展，目前主要应用BRAF、C-KIT原癌基因、MEK、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抑制剂等[11]。免疫治疗是药物通过激活免疫系统，促进免疫系统识别和杀伤肿瘤细胞，缓解病情，目前主要有程序性死亡受体-1(programmed cell death-1，PD-1)/程序性死亡受体-配体1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)抑制剂、细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)单抗等。两种治疗方法各有利弊，靶向治疗虽然在突变患者中有较高的应答率(约70%)和较快的作用，但高通量测序显示主要靶点BRAF和KIT突变率不高，且存在耐药问题；免疫治疗应答率较低(约50%)，肿瘤反应需要更长时间，但对患者基因型要求不高，总体不良反应小，因而免疫治疗成为当前MM治疗的首选，其中以PD-1/PD-L1抑制剂为主的免疫治疗效果喜人，是全球免疫治疗的首选药物之一。虽然许多研究表明化疗联合靶向治疗或者免疫治疗可以增加肿瘤应答率和患者生存期，但总体无进展生存期(progression-free survival，PFS)和ORR仍不令人满意。所以现很多学者致力研究以发现更多靶点，并不断探索已有药物在MM治疗中的潜在价值。

    二、我国MM患者的肿瘤突变基因和突变多样性

    数项针对我国MM患者的基因分析显示主流靶基因突变率不高(BRAF为18%[12]，c-KIT为14%[13]，NRAS原癌基因为12%[14])，3种基因突变率相加不超过50%。Nicholas等[15]对183例MM样本进行了全基因组测序，发现不同亚型MM的主要突变基因差距很大，皮肤型MM的突变位点主要有BRAF、NRAS、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A)、肿瘤蛋白53(tumor protein P53，TP53)等，黏膜、肢端型MM的突变以BRAF、NRAS、神经纤维素1(neurofibromin 1，NF1)等为主。突变率较高且目前存在针对性靶向药物的基因主要有BRAF、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)、乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene，BRCA)、成纤维细胞生长因子受体2(fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2)、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚单位α(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PI3KC)、哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin，mTOR)、KIT、细胞周期依赖性激酶4/6(cyclin dependent kinase 4/6，CDK4/6)、神经营养受体酪氨酸激酶(neurotrophic receptor tyrosine kinase，NTRK)、组蛋白脱乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)、果蝇zeste基因增强子的人类同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)等。黄复雪等[14]的一项黏膜MM患者基因二代测序研究分析了295个肿瘤相关基因，显示多个基因突变率较高，且针对这些基因的靶向药物已经在其他肿瘤患者证明了其疗效，这些基因包括ROS原癌基因1(ROS proto-oncogene 1，ROS1)(12%)、FGFR(12%)，BRCA(8%)、CDK4(8%)、mTOR(8%)，其他突变率较高的基因包括ALK、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、EZH2、NTRK、多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PAPR)等，对这些基因的研究有助于推动个体化医疗的发展。

    三、MM临床分子靶向治疗

    应用于临床的一线分子靶向药物相当有限，主要包括肿瘤通路抑制药物BRAFi、MEKi、KITi，免疫检查点抑制剂PD-1单抗和CTLA-4单抗。BRAFi和MEKi均作用于RAS原癌基因/Raf原癌基因/MEK/胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路，是MM的重要发病通路，BRAF和MEK均是该通路RAS基因下游的重要靶点，代表药物达拉非尼和曲美替尼的联合试验ORR达69%，对BRAF突变亚型患者疗效显著。c-KIT在慢性日光损伤性MM患者中多见，可直接结合生长因子并启动下游MAPK和PI3K-AKT途径，代表药物伊马替尼(ORR为23.3%)，在c-KIT突变患者中有疗效。PD-1抑制剂PD-1i，阻断PD-L1结合并抑制CD8+T细胞活化增殖作用；CTLA-4抑制剂CTLA-4i,阻断B7-CTLA-4途径，抑制其对T细胞的抑制作用从而激活T细胞杀伤肿瘤，代表药物纳武单抗和伊匹单抗联合试验ORR范围在50%~60%[16]。已有多篇文献和综述介绍了上述药物[17,18,19,20]。

    四、MM的潜在靶点和潜力药物

    (一)PI3K/AKT通路

    PI3K蛋白参与细胞的增殖、分化、凋亡等，其主要下游分子AKT可激活多个信号通路，如mTOR、核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，BCL-2)等。有学者综述了mTOR的研究现况，认为激活mTOR和MM的发病密切相关，其中mTOR的组成性激活可以抑制细胞自噬，并干扰正常的细胞周期[21]。FGFR、EGFR、ALK等多种受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)可激活PI3K/AKT通路[22,23,24]。BRAF抑制剂耐药MM是一个至今未解决的临床难题，有学者认为，FGFR/PI3K/AKT通路是MM对抗BRAF抑制剂的耐药通路[23]，BRAF抑制剂联用FGFR抑制剂可降低MM的耐药性，据报道，碱性成纤维细胞生长因子2(basic fibroblast growth factor 2, bFGF)可被信号换能器及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)和PI3K/AKT途径诱导表达，激活FGFR以促进肿瘤血管生成和存活[25]，PI3K/AKT通路可能是MM中FGFR致瘤和耐药的重要通路。研究表明，MM细胞内FGF/FGFR抑制可引起凋亡，且没有其他补救途径[26]。Rezzola等[27]通过癌症基因组图谱数据挖掘发现，在人类葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma，UM)患者中，高水平成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor receptor，FGF)或FGFR表达导致预后不良，通过小鼠体内实验证明，天然FGF抑制剂长五聚蛋白3(long pentraxin 3，PTX3)过表达可以抑制小鼠MM细胞株B16-LS9细胞的致癌活性，过表达PTX3的小鼠接受MM细胞移植时也表现出抗癌活性和较低的肝转移率；在体外实验中，PTX3小分子衍生物NSC12抑制UM的生长和增殖转移，从而提出FGF/FGFR抑制可能是一种新的治疗UM的策略。厄达替尼是FGFR2/3抑制剂，曾因临床募集FGFR突变患者不足而无法开展MM的临床试验。2020年Sarkisian等[28]报道了1例29岁FGFR3突变的脑转移MM患者，使用厄达替尼8 mg/d治疗，期间患者耐受良好，12周后PET/CT显示患者全身病灶和代谢吸收降低了95%，6周时停用地塞米松，16周时颅外疾病仍得到控制，然而颅内病灶数量增加1倍(20~40个);患者在进展前持续约27周的厄达替尼治疗，使得颅外肿瘤持续稳定，收益显著，最终因无法控制颅内肿瘤，放疗效果不佳死亡。虽然厄达替尼的颅内外病灶反应有差异，但约8个月的颅外PFS和95%缓解率相当令人振奋，这也暗示了厄达替尼治疗MM的潜力。培米替尼是一种特异性FGFR2抑制剂，于2020年由FDA批准于美国上市，是首个用于胆管癌的靶向药物，但FGFR2突变MM患者比例较低，开展临床试验较困难，暂时没有完整的临床试验报道。

    与FGFR相似，EGFR似乎同样介导了BRAF突变MM的耐药性，不同的是，在野生型MM中，EGFR的表达水平低于正常细胞[29]。Billing等[22]发现，富含亮氨酸的重复序列和免疫球蛋白样结构域1(leucine rich repeats and immunoglobulin like domains 1，LRIG1)可下调EGFR，通过抑制PI3K/AKT通路，抑制MM活性。另外，Pietraszek-gremplewicz等[30]发现过表达EGFR组和shRNA抑制组比较，过表达组MM细胞的侵袭足(富含肌动蛋白的细胞质凸起)增多，此外EGFR沉默削弱了基质金属蛋白酶9活性，降低了肿瘤细胞溶解细胞外基质的能力。Schicher等[31]对免疫缺陷小鼠进行的体内实验表明，EGFR抑制剂厄洛替尼和血管内皮细胞生长因子受体1(vascular endothelial growth factor receptor 1，VEGFR)抑制剂贝伐珠单抗联用后，肿瘤体积缩小率高于单用的叠加效应，且淋巴结和肺转移范围减少最为显著。2016年，Mudigonda等[32]报道了一项单臂联合贝伐珠单抗和厄洛替尼的Ⅱ期临床试验，入组28例患者，经过治疗，部分缓解(partial response，PR)率为7%(2/28)，中位PFS为2个月，中位总生存期(overall survival，OS)为6.7个月，这一疗效并不令人满意。全球陆续报道的长期使用厄洛替尼后出现暴发性MM的病例，提示厄洛替尼可能破坏EGFR平衡反而导致了肿瘤的形成[33]。围绕其他EGFR抑制剂如凡德他尼、吉非替尼等开展的临床试验也均效果不佳。在2项Ⅱ期临床试验中，每日吉非替尼250 mg队列的PR率仅为4%(2/48)，中位PFS为1.4个月，中位OS为9.7个月；每日凡德他尼100 mg队列的中位PFS也仅比安慰剂组多0.8个月(2.5和3.3个月)，中位OS从2.5个月提高至4.6个月，耐受良好，但收益不高[34,35]。

    其他靶向药物如ALK、mTOR和BCL-2抑制剂等也介导PI3K/AKT通路表现出抗肿瘤活性，如Janostiak等[24]发现ALK抑制剂色瑞替尼阻断了MM的BRAF抑制剂耐药；Dronca等[36]报道的一项Ⅱ期临床试验内替莫唑胺联合mTOR抑制剂依维莫司组患者的ORR率为8.3%(4/48)，这部分患者中位PFS为15.1个月，总体PFS为2.4个月；给予BCL-2反义寡核苷酸联合达卡巴嗪时中位PFS从7.8个月提升至9个月，ORR从7.5%提升至13.5%[37]。

    (二)MAPK通路

    RAS/RAF/MEK/ERK是导致MM的主要信号通路之一，也称MAPK通路[38]。MAPK通路异常激活扰乱MM细胞周期并抑制凋亡[39,40]，BRAF是该通路的经典靶点，BRAF抑制剂在突变型患者中的疗效已被证实。MAPK也是ROS1、NTRK、布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton tyrosine kinase，BTK)等蛋白的下游分子，这些基因的异常激活也可激活MAPK通路。

    NTRK融合突变在棘状黑色素瘤中比较常见，占21%~29%[41]，而在皮肤或黏膜黑色素瘤中< 1%，在肢端黑色素瘤占2.5%。NTRK/RAS/MAPK是重要的细胞激活和发育通路[42]。在一项包括17种不同类型的NTRK融合肿瘤和7例MM患者的研究中，NTRK抑制剂拉罗替尼组ORR达75%(CR＝13%，PR＝62%)，71%的患者持续获益超过12个月，中位反应时间较短，为1.8个月[43]。但MM组的数据未知，且中位PFS较短，拉罗替尼在NTRK突变MM患者中疗效仍难以预测，需要更多临床试验扩充数据。

    BTK抑制剂伊布替尼被发现可以对抗MM的BRAFi耐药，根据Misek等[44]的研究，伊布替尼是唯一能对抗MM的BRAF耐药性的BTKi，进而推测伊布替尼并不是通过靶向BTK来实现此生物学效应，单用伊布替尼可能并不能抑制MM。一项纳入18例MM患者的Ⅰ期临床试验中，伊布替尼组ORR为0，平均PFS为1.3个月，平均OS为6个月[45]。基于这个数据，伊布替尼单药治疗MM的临床试验将难以开展。

    ROS1对人MM的意义尚未明确。一项纳入119例MM患者的logistic回归分析显示，ROS1突变和与日照有关的MM独立相关(P＝0.001)，这是由于突变ROS1组成性激活，导致MAPK通路激活促发肿瘤，但突变率只有11.8%[46]。Newman等[47]报道了一种小儿MM亚型Spitz瘤，其中50%由激酶基因驱动，包括ROS1基因。另一项综合2组临床试验(PD-1i，n＝73；CTLA-4i，n＝110)的分析表明，ROS1突变可能通过增加肿瘤抗原性和基因损伤增强免疫治疗疗效，在伊匹单抗(一种CTLA-4i)治疗的队列中，突变型患者的OS较野生型明显延长，而在非免疫治疗队列中，野生型和突变型患者OS的差异无统计学意义[48]。恩曲替尼是一种特异性ROS1抑制剂，目前还无完整的恩曲替尼单药或联合其他药物治疗MM的临床试验，在明确ROS1在MM中的作用前，研究者可能会谨慎针对恩曲替尼进行MM的临床试验。

    (三)DNA修复与细胞周期

   DNA损伤激活细胞修复机制并停止细胞周期，BRCA、CDK4、EZH2等蛋白调控这一过程[49,50,51]，这些基因的异常表达可能是MM细胞突破检查点的原因。

    PAPR抑制剂广泛应用于BRCA突变阳性肿瘤，有实验表明，单独抑制PAPR并不能抑制MM细胞，但PAPR抑制剂奥拉帕尼与达卡巴嗪合用可以增强达卡巴嗪的抗肿瘤作用；塔拉唑帕尼和尼拉帕尼可以增加肿瘤细胞对电离辐射的敏感性，且对健康细胞影响较小，但效果不稳定[52,53]。一项PAPR抑制剂卢卡帕尼联合全剂量替莫唑胺的Ⅱ期临床试验，比另一项替莫唑胺单药治疗组ORR增加3.9%(13.5%和17.4%)，中位PFS增加8个月(1.9和9.9个月)，中位OS增加2.2个月(7.7和9.9个月)[54]，表明卢卡帕尼可以安全联用替莫唑胺而增加中位PFS。肿瘤抑制因子p16(tumor suppressor p16，p16)/细胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)/CDK4/RB转录辅阻遏物1(RB transcriptional corepressor 1，RB1)通路促进细胞周期G1到S，CDK4突变会导致p16功能异常，产生类似p16丢失的生物学行为，从而诱发肿瘤[50,55]。在晚期MM患者中进行的CDK4抑制剂玻玛西林的2项临床试验，ORR为0和3.8%[56,57]。比美替尼45 mg 2次/d+瑞博西林200 mg 1次/d治疗MM的Ⅱ期临床试验中，ORR＝19.5%(8/49)，对比另一项比美替尼同剂量治疗组(n＝158，ORR＝12%)有显著提高[58]。总体来说，目前CDK4抑制剂的单药疗效不理想，但增强了比美替尼的疗效。

    针对182例MM患者的全基因测序研究表明EZH2具有高突变率[15]，过表达EZH2可下调多个靶基因，包括抑癌基因CDKNIA、p16INK4a，抑制CDK4途径促进MM细胞凋亡逃逸[59]。目前EZH2抑制剂他泽司他尚无针对MM的完整临床试验。

    (四)其他

    B淋巴细胞抗原CD20是经典的B细胞表面标志物，CD20抑制剂利妥昔单抗(商品名美罗华)已经在中国上市，主要用于治疗白血病和淋巴瘤。虽然耐受良好，但以往的临床试验显示利妥昔单抗耗竭B细胞，对白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)治疗MM并没有帮助[60,61]。有学者认为长时间的免疫抑制会增加多痣体质和阳光照射人群罹患MM的风险，并提出"美罗华相关MM"这一概念[62]。最新的研究表明，CD20可能参与MM细胞BRAF耐药[63]；Tim-3是多种免疫细胞和白血病干细胞表达的检查点受体，代表药物sabatolimab已在联合PD-1i治疗晚期实体肿瘤上表现出抗肿瘤活性[64,65]；激动性CD40抗体可介导树突状细胞激活T细胞发挥抗肿瘤作用[66]；糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(glucocorticoid-induced TNFR-related protein，GITR)通过激活T细胞和抑制Treg细胞，增强免疫系统清除肿瘤[67]，GWN323(GITR抗体)联合PD-1i治疗肿瘤的临床试验已有报道[68]。这些药物的临床试验正在MM患者群体开展，有望为其治疗注入新的血液。多靶点药物包括达沙替尼、乐伐替尼、普纳替尼、米哚妥林等，这些药物的疗效均未能赶超目前一线药物，且安全性并不占优势[69,70]。

   综上所述，传统化疗药物达卡巴嗪治疗MM的ORR约为5%，PD-1i问世后，将ORR提升至20%左右，靶向药物如KIT抑制剂伊马替尼的ORR达到23%左右，但疗效仍不够理想，联合药物治疗则显著增加了ORR。单药临床试验中，罗拉替尼在实体肿瘤队列表现突出，但缺乏MM组的数据；达沙替尼对于KIT(+)患者的ORR接近20%，但不如伊马替尼且毒性较强；厄达替尼对FGFR3突变患者达到95%缓解，但FGFR3突变患者较少，目前报道的病例不足以支持其疗效。此外，多种药物在联合治疗(化疗或靶向治疗)中表现出较好疗效，如西罗莫司联合贝伐珠单抗的ORR达到17.7%，比依维莫司联合贝伐珠单抗的ORR高5.7%，卢卡帕尼联合替莫唑胺可将ORR提升3.9%，BCL-2反义寡核苷酸联合达卡巴嗪将ORR提升6%，瑞博西尼将比美替尼的ORR提升7.5%。这些药物单独使用的疗效不令人满意，联合药物却能显著提升疗效，提示对应通路和潜力药物在MM靶向治疗的潜力，为多靶点治疗的药物选取提供了参考。

    ALK、BCL-2、BTK、CD20等均被证明和MM耐药性有关，这些靶点抑制剂联合相应药物(BRAFi、PD-1i或传统化疗药物)的临床试验正在开展，有望为解决药物耐药的问题提供参考和帮助。

    五、小结

    黑色素瘤恶性程度高，整形外科常见的晚期MM对传统化疗药物不敏感，临床上首选免疫治疗。靶向治疗在突变患者中疗效优于传统化疗药物，较免疫治疗反应更快，但耐药后效果差。随着以BRAFi达菲替尼和PD-1i纳武单抗为代表的药物上市，当今阶段的新辅助治疗较传统化疗已取得缓解率和生存期上的长足进步，但疗效仍不满意。对于不同地区、不同病理类型、不同时期的MM，靶向药物的应答大相径庭。全球正在不断探索潜在靶点在各种体内和体外MM中的作用，并开展相应药物针对特定MM的临床试验，即使这些潜力药物暂未被批准用于MM治疗，但针对个别病例的疗效已有报道。相比于单药治疗，联合药物治疗疗效强，不良反应轻微，在新登记于clinicaltrials.gov的100条临床试验中，联合药物试验的数目约是单药治疗研究的3.7倍(41/11),随着多靶点治疗的优势被证明和单药疗法的开发速度逐渐放缓，研究者可能会把研究重点放在多靶点治疗的组合设计及针对少数突变患者的个体化用药上，这个状态可能会持续一段时间，直到发现MM的核心机制和特效药。

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参考文献

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第十四期内容

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