Notch信号通路对婴幼儿血管瘤间充质干细胞成脂分化的影响

Notch信号通路对婴幼儿血管瘤间充质干细胞成脂分化的影响

王维东沈卫民韩涛王媛陈昇林家玮

本文来源：《中华整形外科杂志》2023年7月第39卷第7期

DOI:10. 3760 / cma.j.cn114453-20220322-00082

作者单位：南京医科大学附属儿童医院烧伤整形科，南京210008

通信作者：沈卫民，Email：swmswmswm@sina.com

引用本文

王维东,沈卫民,韩涛,等. Notch信号通路对婴幼儿血管瘤间充质干细胞成脂分化的影响[J]. 中华整形外科杂志,2023,39(07)：762-769.DOI:10.3760/cma.j.cn114453-20220322-00082

【摘要】

目的研究Notch信号通路对婴幼儿血管瘤间充质干细胞(Hem-MSCs)成脂分化的影响及其可能机制。

方法选取2021年1至6月南京医科大学附属儿童医院烧伤整形科手术切除的10例婴幼儿血管瘤标本(男6例，女4例，年龄2至6个月，平均3.5个月)。用贴壁筛选法从增生期血管瘤中分离Hem-MSCs，通过流式细胞术进行鉴定。鉴定成功后进行成脂诱导。使用实时荧光定量PCR检测Hem-MSCs成脂诱导14 d后Notch1、Jagged1及Hes1基因表达情况。在Hem-MSCs培养基中分别加入Notch信号通路抑制剂DAPT、PI3K/AKT信号通路激动剂740Y-P及溶剂DMSO，再进行成脂诱导。将细胞分为6组：空白对照组、成脂诱导组、成脂诱导+DMSO组、成脂诱导+DAPT组、成脂诱导+740Y-P组、成脂诱导+DAPT+740Y-P组。成脂诱导7 d后，蛋白质印迹法检测成脂诱导+DMSO组、成脂诱导+DAPT组、成脂诱导+DAPT+740Y-P组p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表达情况；成脂诱导14 d后，实时荧光定量PCR检测上述6组细胞中成脂分化关键转录因子中PPARγ和C/EBPα基因表达情况；油红O染色鉴定成脂效果。两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，组内比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果 Notch1、Jagged1及Hes1在Hem-MSCs成脂诱导过程中表达逐渐降低，差异均有统计学意义(tNotch1＝8.99，PNotch1＝0.008；tJagged1＝9.49，PJagged1＝0.007；tHes1＝7.74，PHes1＝0.015)。在Hem-MSCs成脂诱导过程中加入Notch信号通路抑制剂DAPT后，PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达降低，差异有统计学意义(qp-PI3K＝4.78、Pp-PI3K＝0.014，qp-AKT＝5.04、Pp-AKT＝0.010)；相关成脂指标表达增高(q油红O＝6.07，P油红O＝0.003；qPPARγ＝17.34，PPPARγ<0.001；qC/EBPα＝14.8，PC/EBPα<0.001)，差异均有统计学意义。加入PI3K/AKT信号通路激动剂740Y-P后，相关成脂指标无明显变化，差异均无统计学意义(q油红O＝1.82，P油红O＝0.786；qPPARγ＝0.97，PPPARγ＝0.981；qC/EBPα＝1.98，PC/EBPα＝0.654)。同时加入DAPT和740Y-P后，相关成脂指标表达降低(q油红O＝5.22，P油红O＝0.013；qPPARγ＝9.78，PPPARγ<0.001；qC/EBPα＝16.74，PC/EBPα < 0.001)

结论抑制Notch信号通路可以通过降低PI3K/Akt信号通路活性促进Hem-MSCs向脂肪细胞分化。

【关键词】血管瘤；间充质基质细胞；Notch信号通路；成脂分化

基金项目：南京医科大学科技发展基金（NMUB2020088）

Effects of Notch signaling pathway on the adipogenic differentiation of infantile hemangioma-derived mesenchymal stem cells

Wang Weidong, Shen Weimin, Han Tao, Wang Yuan, Chen Sheng, Lin Jiawei

Department of Burns and Plastic Surgery，Children’s Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210008,China

Corresponding author: Shen Weimin，Email：swmswmswm@sina.com

【Abstract】

Objective To study the effects and potential mechanisms of Notch signaling pathway on the adipogenic differentiation of infantile hemangioma-derived mesenchymal stem cells.

Methods From January 2021 to June 2021, 10 infantile hemangioma specimens (6 males and 4 females, aged 2 months to 6 months, average age 3.5 months) were collected from the Department of Burns and Plastic Surgery of the Children’s Hospital of Nanjing Medical University. Hem-MSCs were isolated from hemangioma in the proliferating phase by adherent screening and identified by flow cytometry. Adipogenic induction was performed after successful identification. Real-time quantitative fluorescence PCR was used to detect the expression of Notch1, Jagged1 and Hes1 genes after 14 days of adipogenesis induction of Hem-MSCs. The Notch signaling pathway inhibitor DAPT, PI3K/Akt signaling pathway agonist 740Y-P and solvent DMSO were added to Hem-MSCs, and adipogenesis induction was performed. The cells were divided into six groups: control group, adipogenic induction group, adipogenic induction+ DMSO group, adipogenic induction+ DAPT group, adipogenic induction+ 740Y-P group, and adipogenic induction+ 740Y-P+ DAPT group. After 14 days of adipogenic induction, real-time quantitative fluorescence PCR was used to detect the expression of PPARγ and C/EBPα genes in the key transcription factors of adipogenic differentiation in the above six groups. Oil red O staining was applied to identify the adipogenic differentiation capabilities; after adipogenic induction for 7 days, the expression levels of p-PI3K, PI3K, p-AKT, and AKT proteins in the adipogenic induction+ DMSO group, adipogenic induction+ DAPT+ 740Y-P group were detected by western blotting. In comparing the two groups, an unpaired Student’s t-test was used to assess the differences, and analysis of variance was applied for the analysis of the mean values among multiple groups. and P<0.05 was considered statistically significant.

Results The expression levels of Notch1, Jagged1 and Hes1 decreased gradually during the adipogenic induction of Hem-MSCs, and the differences were statistically significant (tNotch1=8.99, PNotch1=0.008; tJagged1=9.49, PJagged1=0.007; tHes1=7.74, PHes1=0.015). After the addition of Notch signaling pathway inhibitor DAPT during the adipogenic induction of Hem-MSCs, the expression of proteins associated with PI3K/AKT signaling pathway decreased, and the difference was statistically significant (qp-PI3K=4.78, Pp-PI3K=0.014; qp-AKT=5.04, Pp-AKT=0.010) and the expression of adipogenesis indexes increased (qOil red O=6.07, POil red O=0.003; qPPARγ=17.34, PPPARγ<0.001; qC/EBPα=14.8, PC/EBPα<0.001). There was no significant change in adipogenesis indexes after addition of PI3K/Akt signaling pathway agonist 740Y-P (qOil red O=1.82, POil red O=0.786; qPPARγ=0.97, PPPARγ=0.981; qC/EBPα=1.98, PC/EBPα=0.654). The expression of adipogenesis indexes decreased after adding DAPT and 740Y-P(qOil red O=5.22, POil red O=0.013; qPPARγ=9.78, PPPARγ<0.001; qC/EBPα=16.74, PC/EBPα<0.001).

Conclusion The inhibition of Notch signaling pathway can promote the adipogenic differentiation of Hem-MSCs by reducing the activity of PI3K/Akt signaling pathway.

【Key words】Hemangioma; Mesenchymal stem cells; Notch signaling pathway; Adipogenic differentiation

Fund program: Science and Technique Development Foundation of Nanjing Medical University（NMUB2020088）

Disclosure of Conflicts of Interest: The authors have no financial interest to declare in relation to the content of this article.

Ethical Approval: Ethical approval was given by the Medical Ethics Committee of Children’s Hospital of Nanjing Medical University(201902068-1)

婴幼儿血管瘤(infant hemangioma, IH)是一种好发于婴幼儿的良性软组织肿瘤。一般在出生数日内被发现，出生6个月为快速增殖期，在1岁左右进入消退期。目前IH的增殖及消退机制尚未明确，可能与多种血管瘤细胞及多种信号通路共同作用有关。目前有关血管瘤的消退机制研究主要集中于2个方面：血管瘤内皮细胞的凋亡[ 1 ]和血管瘤消退过程中的脂肪形成[ 2 ]。Notch信号通路是一种高度保守的信号通路，在调节细胞增殖与分化中都有着重要作用[ 3 ]。我们前期的研究结果表明，血管瘤间充质干细胞(hemangioma-derived mesenchymal stem cells, Hem-MSCs)中也存在活化的Notch信号通路。抑制Notch信号通路可以促进Hem-MSCs的增殖，反之则结果起抑制作用[ 4 ]。但Notch信号通路在Hem-MSCs成脂分化过程中的作用尚未见报道。本研究通过在体外培养Hem-MSCs，并进行成脂诱导分化，观察干预Notch信号通路后对Hem-MSCs成脂分化的影响，进一步探讨干预Notch信号通路对Hem-MSCs成脂分化的影响及其可能的机制。

材料和方法

一、实验材料

选取2021年1至6月南京医科大学附属儿童医院烧伤整形科10例行手术切除的IH标本，其中男6例，女4例，年龄2~6个月，平均3.5个月，皆为单发的血管瘤。纳入标准：未经过任何治疗，无感染破溃，术后病理证实均为增生期IH。排除标准：术后病理证实为非增生期IH。

标本应用经南京医科大学附属儿童医院医学伦理委员会审核批准并征得患儿家属同意(201902068-1)。

二、主要试剂与仪器

(一)主要试剂

低糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、0.2%胶原酶A (Gibico公司，USA)；成脂分化诱导液：3-异丁基-1-甲基黄嘌呤( 3-Isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、生物素泛酸、牛胰岛素、地塞米松、罗格列酮(Sigma公司，USA)；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、封闭缓冲液(blocking buffer，BSA)、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)(上海碧云天公司)；油红O染色液(G1262)、4%多聚甲醛(Sigma公司，USA)；SYBR Green qPCRMaster Mix试剂盒、反转录试剂盒(Abcam公司，UK)；(美国ABI公司)，异硫氰酸荧光素(fluorescein lisothiocyanate, FITC)标记的CD90、CD105、CD34、CD45抗体及相对应的同型对照抗体(美国Biolegend公司)；p-PI3K(no.17366)、PI3K(no.4288)、p-AKT(no.9271)、AKT抗体(no.9272)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、内参β-actin抗体(no.3700)(CST公司，USA)；PI3K/AKT信号通路激动剂740Y-P、Notch信号通路抑制剂γ-分泌酶抑制剂(N-[N-(3，5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycinet-butyl ester，DAPT)(Abcam公司，UK)；PCR试剂盒(TaKaRa，Japan)、PCR引物(南京金斯瑞公司)。

(二)主要实验仪器

倒置相差显微镜(德国Leica公司)，实时荧光定量PCR仪(ABl7700，美国ABI公司)，Nanodrop 2000超微量分光光度计(thermo公司，USA)，全自动定量绘图酶标仪(美国Bio-Tek公司)，FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)。

三、实验方法

(一)Hem-MSCs的分离、培养及鉴定

参考Yuan等[ 5 ]的方法进行Hem-MSCs分离培养。去除新鲜血管瘤标本上皮肤和脂肪组织后将其剪碎，加入0.2%胶原酶A后，混匀震荡，37 ℃水浴下消化2 h。当组织已经分散成小细胞团块时加入配置的低糖DMEM培养基及FBS。使用70 μm孔径筛网过滤后得到单细胞悬液。在室温下，加入适量红细胞裂解液后离心5 min，离心转速为1 000 r/min，离心半径为10 cm，吸取上清后弃去。重悬细胞后接种于6 cm培养皿。次日换液，去除未贴壁的悬浮细胞，将贴壁细胞继续培养，得到原代Hem-MSCs。培养3~5 d后进行传代，培养至第4代Hem-MSCs进行鉴定。使用0.25%胰酶消化后1 000×g离心5 min, PBS缓冲液洗涤2次后重悬于BSA缓冲液中，并在4 ℃冰箱中与CD90、CD105、CD34、CD45抗体共染色10 min，染色细胞经PBS冲洗2次后在流式细胞仪上进行检测。

(二)Hem-MSCs成脂诱导

取增生期血管瘤标本培养的第4代Hem-MSCs进行成脂诱导，以5×104/ml的细胞密度接种于6孔板，每孔中加入2 ml细胞悬液。成脂诱导培养基的配置：完全培养基中加入17 μmol/L泛酸、1×10－6 mol/L地塞米松、33 μmol/L生物素、5 μmol/L罗格列酮、10 μmol/L胰岛素、0.5 mmol/L IBMX；当细胞汇合达到80%~90%时，更换为上述成脂诱导培养基。每隔2 d换液1次，成脂诱导14 d后，行油红O染色鉴定成脂效果。

(三)实时荧光定量PCR检测Hem-MSCs成脂诱导后14 d的 Notch1、Jagged1、Hes1、PRAR-γ及C/EBPα的基因表达

在Hem-MSCs成脂诱导后14 d，用Trizol法[ 6 ]提取细胞总RNA并检测所提取总RNA的纯度及浓度。引物Oligo(dT) 、1 500 ng的RNA、M-MLV反转录酶、dNTP mix混合后用PCR扩增仪合成cDNA。在20 μl的反应体系下进行PCR扩增。扩增程序为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，共40个循环。使用实时荧光定量PCR仪进行数据分析。β-actin为内参基因，应用2－△△CT法进行相对表达水平的计算。引物序列见表1 。

(四)细胞干预

将DAPT及740Y-P分别溶于DMSO中，于4 ℃冰箱避光保存。取培养的第4代Hem-MSCs，以5×104/ml的细胞密度接种于6孔板，每孔加入2 ml细胞悬液。细胞汇合达到70%~90%时，更换成脂诱导培养基。不同处理组内每次换液加入不同试剂进行干预。细胞分为6组：1个培养皿中仅加入成脂诱导培养基，为成脂诱导组；1个培养皿中加入DAPT和DMSO混合液，使DAPT的终浓度为10 μmol/L,为成脂诱导+DAPT组；1个培养皿中加入740Y-P和DMSO混合液，使740Y-P的终浓度为10 μmol/L,为成脂诱导+740Y-P组；1个培养皿中同时加入DAPT、740Y-P和DMSO混合液，为成脂诱导+DAPT+740Y-P组，使DAPT和740Y-P的终浓度皆为10 μmol/L；为排除溶剂影响，1个培养皿中仅加入DMSO，为成脂诱导+DMSO组；4个培养皿中DMSO浓度保持一致；同时设立只加入低糖DMEM培养基，为空白对照组。每2 d换液1次，连续培养14 d。

(五)Hem-MSCs成脂诱导14 d后油红O染色及半定量分析

将成脂诱导14 d后的各组细胞，每孔加入2 ml的4%多聚甲醛固定细胞30 min，用三蒸水漂洗3次，60%异丙醇漂洗1次，每孔加入油红O染色液1 ml,室温染色20 min。再用三蒸水洗涤2次，镜下观察拍照。半定量分析：每孔加入异丙醇1 ml孵育15 min,转移到96孔板，每个样本至少3个复孔，酶标仪检测490 nm处吸光度，取均值进行统计分析。

(六)蛋白印迹法检测成脂诱导组，成脂诱导+DMSO组，成脂诱导+DAPT组细胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT的蛋白表达情况

取细胞干预后的成脂诱导组、成脂诱导+DMSO组和成脂诱导+DAPT组Hem-MSCs，成脂诱导分化7 d之后，吸除培养基，用PBS洗涤细胞3次。加入蛋白裂解缓冲液，收集细胞总蛋白，并测定收集蛋白浓度。取30 μg蛋白进行垂直电泳分离。取出凝胶漂洗后转至PVDF膜上，用50 g/L脱脂牛奶在室温封闭1 h。在上述3组分别加入p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT的抗体4 ℃孵育过夜。第2天，在室温下用PBS洗涤3次，再加入山羊抗小鼠IgG孵育2 h，加入显影液，曝光显影，检测各组别中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT的蛋白表达情况。采用Adobe Photoshop进行蛋白相对表达水平分析。

目的蛋白相对表达水平＝目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值

四、统计学方法

采用Graphpad Prism 8. 0软件进行统计学分析。所有计量资料均符合正态分布及方差齐性，以x

±s表示。两组间指标比较采用t检验。多组间指标比较采用方差分析，组内间比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、Hem-MSCs的细胞形态学观察及鉴定

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Notch信号通路对婴幼儿血管瘤间充质干细胞成脂分化的影响