卡波西样淋巴管瘤病的遗传学机制及相应特异性治疗

    泛发性淋巴管异常(generalized lymphatic anomaly，GLA)是一种罕见的、常累及多个器官的弥漫性或多中心性病变，包括骨、肝、肺、纵隔和软组织。2018年，国际脉管疾病研究学会(International Society for the Study of Vascular Anomalies，ISSVA)将卡波西样淋巴管瘤病(kaposiform lymphangiomatosis，KLA)归类为GLA的一种预后不良的新型亚型[ 1 ]。在考虑GLA的诊断时，如果合并出血性积液、广泛的腹膜后或纵隔受累、临床病程恶化或相关的血液学异常，应怀疑KLA。活检仍是确认KLA的必要手段。目前认为，镜下观察到梭形淋巴管内皮细胞是诊断KLA的必要条件[ 2 ]。在国内，邱桐等[ 3 ]报道了8例KLA患者，采用了对症手术治疗和(或)经验性药物治疗，但治疗效果均不理想。本文就KLA的临床表现、组织病理学特征以及相关的遗传学研究进展进行总结，旨在进一步探索特异的靶向治疗方法。

     一、临床表现

    KLA患者常见的临床表现包括出血、呼吸道症状、皮下肿块和骨质受累[ 4 ]。(1)KLA患者通常伴有凝血功能异常，这种凝血功能异常类似于在卡波西样血管内皮瘤(kaposiform hemangioendothelioma，KHE)患儿中常见的卡梅现象，常表现为血小板减少、低纤维蛋白原血症、凝血酶原时间延长和(或)活化的凝血活酶时间延长[ 2 ]，导致的出血可见于全身各处，如鼻出血、巩膜出血、皮肤淤斑及出血性积液等，但KLA的血小板下降程度较卡梅现象轻，所以通常不会导致深部出血。(2)几乎所有的KLA患者都会累及胸腔，最常见的呼吸道症状是由于胸腔或心包积液引起的咳嗽、呼吸困难和胸痛。(3)KLA患者的皮下肿块通常表现为弥散、柔软的无痛性肿块，随着病变的发展可逐渐演变为患侧髋部或下肢的张力性水肿，皮肤呈蓝紫色改变并伴有淋巴小泡形成。(4)与GLA类似，KLA通常伴有骨质受累，但病变通常不会累及皮质骨，且病情进展一般都为非进行性[ 5 ]。Liu等[ 6 ]报道1例累及脊髓的KLA。骨质病变会导致行走时疼痛以及患肢功能受限。

     二、组织病理学特征

    大量的研究表明，KLA在镜下可见成簇状或片状以异常扩张形式增殖、排列的梭形淋巴管内皮细胞，簇状的细胞通常有含铁血黄素颗粒，常见的是散布的红细胞和其他造血细胞，血栓并不常见[ 7 , 8 , 9 ]。应特别注意与KHE相鉴别，Ji等[ 7 ]发现与KHE中常见的融合成血管结节的梭形细胞不同，KLA中的梭形细胞呈边缘稀疏的簇状分布，且KHE中血栓形成更常见[ 10 ]。KLA细胞免疫反应标志物CD31、CD34、D2-40、PROX-1阳性。Nozawa等[ 8 ]的研究还发现KLA细胞表达间充质干细胞标志物CD90和CD105。

     三、诊断

    KLA是一种复杂的淋巴管异常疾病，其诊断需要综合分析临床表现、影像学、血液学和组织病理学特征。组织病理学是诊断KLA最主要的依据，特征是异常扩张的淋巴管和成簇状分布的梭形淋巴管内皮细胞，D2-40和PROX1免疫阳性[ 7 , 8 , 9 ]。进行活检时由于取样部位的选择，有时活检结果可能仅有异常的淋巴管，但缺乏簇状细胞团。首先，在某些情况下，细胞团的高度管状化会导致KLA与其他淋巴管异常疾病难以鉴别。其次，若淋巴管内充血，无论是自发性出血，还是伴发出血性疾病，都需要注意与其他血管性疾病相鉴别[ 9 ]。

KLA的临床表现特异性较低，但上述临床表现可以提示可能为KLA。影像学在KLA的诊断中是必不可少的，其影像学表现与GLA有着很大相似性，都表现为纵隔和软组织浸润[ 11 ]。淋巴管造影可见类似淤血和返流的表现[ 12 ]。但胸部病变在KLA中更为突出，软组织影可从纵隔延伸到支气管血管束[ 13 ]。此外，KLA的软组织影在磁共振成像上可表现为中度强化[ 11 ]。KLA和GLA中均可观察到骨质受累，GLA的骨质病变通常离散，且边界清楚，KLA的骨质病变则多呈弥散性，浸润性较强[ 14 ]。骨质病变的分布不是一个重要的鉴别因素，但椎体是KLA最常见的受累部位[ 11 ]。

    总之，由于KLA病程进展较快且侵袭性较强，所以KLA的诊断至关重要。组织病理学是诊断KLA的主要依据，但通常可以根据临床表现以及影像学特征做出初步诊断。如果临床上认为有必要，可以进行活检或分子研究。

     四、KLA的遗传学研究进展

     (一)NRAS基因突变

    NRAS基因是一种原癌基因，编码NRAS蛋白[ 15 ]。NRAS蛋白具有鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate，GTP)酶活性，通过与鸟苷二磷酸结合的非活性状态和活性状态之间进行转换，起到分子开关的作用[ 16 ]。它们通过激活不同的下游信号通路，包括RAF-MEK-ERK和PI3K-AKT-mTOR通路，在调节细胞增殖、分化和存活中发挥核心作用[ 17 , 18 ]。NRAS基因在人类癌症中经常发生突变，在超过20%的黑色素瘤患者中均发现了其突变[ 19 ]。

    2019年，Barclay等[ 20 ]通过对11例KLA患者的病变组织取样进行外显子测序，并进一步进行微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR)检测，在10例患者中发现了NRAS基因错义突变(c.182 A>G, p．Q61R)。Ozeki等[ 21 ]通过外显子测序和ddPCR在1例KLA患者的左侧胸壁活检组织和4例KLA患者的胸腔积液标本中同样发现了NRAS基因错义突变(c.182 A>G, p．Q61R)。Ji等[ 7 ]在进行KLA与KHE的对比研究时，纳入的11例KLA患者中均发现了NRAS基因错义突变(c.182 A>G, p．Q61R)，而KHE患者中均未发现该突变。

     (二)CBL基因突变

     CBL基因是一种原癌基因，其编码的CBL蛋白家族通过其E3泛素连接酶活性参与多种信号通路的负向调控。Belizaire等[ 22 ]发现，当敲除突变的CBL基因或使用达沙替尼抑制LYN酪氨酸激酶的活性时，突变细胞中PI3K/Akt信号转导通路的活性大幅下降。因此，他们认为在CBL突变的细胞中，LYN酪氨酸激酶激活引起的下游PI3K/Akt信号转导通路的过度激活是导致肿瘤发生的可能因素。CBL基因突变在青少年骨髓单核细胞白血病和急性淋巴细胞白血病及Noonan综合征中都有发现[ 23 ]。

    2020年，Foster等[ 24 ]在收治的1例难治性KLA患者的胸腔积液引流样本中，使用全外显子测序检测发现了CBL基因突变(c.2322 T>G：p.Y774*)，并进一步进行了ddPCR检测，也同样检测到了该突变。

     五、突变涉及的信号通路

     (一)PI3K-AKT-mTOR通路

    PI3K-AKT-mTOR通路在调节细胞的增殖、生长、细胞大小和新陈代谢等方面起着重要作用。多种生长因子和信号传导复合物都能启动磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)的激活过程[ 25 ]。活化的PI3K能够磷酸化其下游的蛋白激酶B (protein kinase B, AKT)[ 26 ]。磷酸化的AKT通过激活下游效应分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)上调各种转录因子，促进蛋白质合成、细胞生长、细胞存活和运动。

    NRAS p．Q61R突变和CBL突变会导致PI3K-AKT-mTOR通路的过度激活。该通路的异常激活与多种肿瘤的发生有关。目前已经确定抑制该通路可控制肿瘤的生长，PI3K抑制剂和mTOR抑制剂也已经获得食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准投入临床使用[ 27 ]。Boscolo等[ 28 ]通过药物抑制实验也证实了KLA患者病变组织中PI3K-AKT-mTOR通路处于高度激活状态。

     (二)RAS-MAPK-ERK通路

   RAS基因包括HRAS、KRAS、NRAS。他们通过RAS-MAPK-ERK信号通路调节血管内皮生长因子受体3(vascular endothelial growth factor receptor 3，VEGFR3)的表达，进一步调节淋巴内皮细胞的增殖和淋巴管发育[ 29 ]。Lapinski等[ 30 ]在RASA1基因(编码RAS的负调控因子p120RasGAP)或其相互作用的基因MAP4K4缺乏的小鼠中观察到淋巴管异常增生，这一发现进一步强调了RAS信号在控制淋巴管内皮细胞增殖和淋巴管发育中的重要作用。NRAS p．Q61R突变会破坏NRAS蛋白内在的GTP酶活性，使得NRAS始终处于与GTP结合的活性构象中[ 31 ]，最终导致下游通路的过度激活，淋巴管内皮细胞过度增生。

    六、KLA的潜在药物治疗靶点

    靶向治疗相较于手术治疗有不良反应小、无创等优点，是近年来的研究热点。鉴于当前KLA仍没有标准有效的治疗方法，针对KLA发病相关信号通路的靶向治疗药物在未来或许可以应用到KLA的治疗中，以抑制病变的生长。KLA中常见的NRAS突变在黑色素瘤、非小细胞性肺癌及急性粒细胞性白血病中都有发现[ 32 ]。针对这些疾病的靶向治疗药物已经投入临床使用，虽然不能直接照搬其治疗方法，但这也给KLA未来的治疗研究带来了启示。

     (一)mTOR抑制剂

    mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于PI3K相关激酶家族，在调控许多通路的信号传导中发挥着重要作用。细胞中mTOR以2种复合物的形式存在：mTORC1和mTORC2。西罗莫司是mTOR特异性抑制剂，长期给药可同时抑制mTORC1和mTORC2，在临床上最初被用作肾移植后的免疫抑制剂[ 33 ]。西罗莫司也是目前在KLA治疗中使用较多的药物，通常是在进行了其他联合对症治疗后长期服用。维持使用西罗莫司后大部分患者能达到部分缓解，但也有些患者对治疗不敏感[ 34 ]。有临床报道西罗莫司联合长春新碱和糖皮质激素成功治疗KHE的案例[ 35 ]，该方案或许可用于KLA的治疗中，但可供参考的临床资料较少。考虑到KLA的难治性，可在进行对症治疗后长期服用西罗莫司来控制病情的进展。

     (二)PI3K抑制剂

    PI3K属于脂质激酶家族，根据催化亚基的不同可分为PI3Kα、PI3Kβ和PI3Kδ 3个亚型。目前，一些PI3K抑制剂已经被开发出来，并正在进行癌症治疗的临床试验[ 36 ]。这些药物包括泛PI3K抑制剂和PI3K异构体选择性抑制剂。一种对δ亚型有选择性的PI3K抑制剂伊德拉利西布(idelalisib)现在已被FDA批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病、复发性滤泡性B细胞性非霍奇金淋巴瘤和复发性小淋巴细胞性淋巴瘤[ 37 ]。

    Boscolo等[ 28 ]通过体外实验发现PI3Kα亚型(由PIK3CA基因编码)的特异性抑制剂BYL719、LY294002对KLA细胞的增殖有明显的抑制作用。编码PI3Kα的PIK3CA基因突变是各种肿瘤中最常见的突变[ 38 ]，在一些过度生长综合征如CLOVES综合征中也有发现[ 39 ]，目前尚不明确KLA中是否存在PIK3CA突变，但NRAS突变也会引起PI3K-AKT通路的过度激活，所以PI3K抑制剂在未来可能可用于KLA的治疗中。

     (三)AKT抑制剂

    AKT是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是PI3K通路下游的调节分子，在调控细胞生存、胰岛素信号、血管生成和肿瘤形成中扮演着重要的角色。由于PI3K/AKT通路在多种类型的人类肿瘤中具有重要作用，AKT抑制剂的开发一直是治疗癌症的热点。目前已经开发出来的AKT抑制剂包括变构AKT抑制剂和三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate，ATP)竞争性抑制剂[ 40 ]，由于ATP竞争性抑制剂的不良反应较多，所以目前研究热点主要集中在变构AKT抑制剂。目前已有多种AKT抑制剂进入了Ⅲ期临床试验[ 41 ]，未来有望用于与AKT有关的肿瘤的治疗中。Boscolo等[ 28 ]的研究也显示RQ092对KLA细胞的增殖有抑制作用。

    (四)NRAS抑制剂

    RAS蛋白是生长因子诱导细胞增殖和存活的中枢调节因子，是细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)信号通路、PI3K通路和Ral-GEFs通路的上游因子[ 42 ]。RAS的异常激活与多种癌症密切相关。但到目前为止仍没有有效的RAS抑制剂投入临床使用。究其原因，首先是RAS蛋白的三级结构非常光滑，很难为小分子抑制剂提供一个有效的结合位点。此外，RAS蛋白对GTP的亲和力非常高，因此直接开发竞争性抑制剂也几乎是不可能的[ 31 ]。目前认为RAS蛋白的亚型之一NRAS蛋白与KLA发病相关性较大。

    2019年，Yin等[ 43 ]发现了新型的NRAS激活剂：丝氨酸/苏氨酸激酶19(serine/threonine kinase 19，STK19)。STK19可磷酸化NRAS并增强其与下游效应分子的结合，从而促进致癌NRAS介导的黑素细胞恶性转化。随后，他们开发了ZT-12-037-01(1α)，一种特异性的STK19靶向抑制剂，并表明它在体内外有效地阻止了由NRAS驱动的致癌黑素细胞恶性转化和黑色素瘤生长。KLA中也有与黑色素瘤类似的NRAS突变，这种特异性STK19抑制剂在未来或许可以用于KLA的治疗中。

     (五)MEK抑制剂

    MEK是一种双重特异性激酶，包括MEK1和MEK2。MEK抑制剂可分为ATP竞争性抑制剂和非ATP竞争性抑制剂[ 44 ]。曲美替尼是第一个上市的MEK抑制剂，于2013年被批准为治疗BRAF V600E转移性黑色素瘤的药物。但是接受MEK抑制剂治疗的患者通常会在几个月内产生耐药性。耐药机制主要是MAPK通路或ERK的重新激活，或者是由于上游的RAS蛋白绕过MAPK通路激活了其他信号通路，如PI3K-AKT-mTOR通路[ 45 ]。为了应对MEK抑制剂治疗时产生的耐药性，已经有许多基础的临床试验在研究同时抑制多条通路的的联合疗法[ 46 ]。达普拉非尼(一种BRAF抑制剂)和曲美替尼的联合用药方案已经获得监管部门的批准，用于治疗晚期黑色素瘤，这种联合用药方案增加了晚期黑色素瘤患者的无进展存活率(与单独使用这2种药物相比)[ 47 ]。

    Foster等[ 24 ]对1例伴有CBL基因突变的难治性KLA患者使用了MEK抑制剂曲美替尼治疗，初始剂量为0.5 mg/d(每次0.01 mg/kg)，治疗1个疗程(28 d)后患者自觉呼吸困难、咳嗽明显减轻。3个疗程后复查肺功能显示限制性肺疾病明显好转，胸部CT显示胸腔积液和肺间隔内增厚几乎完全消失。总体治疗效果较好，患者只出现了轻度不良反应，包括痤疮样皮疹、短暂的嗜酸细胞增多症、短暂的血尿和蛋白尿，但都很快得到解决。

    Chowers等[ 48 ]对1例伴有NRAS (p.Q61R)突变的9岁KLA患儿使用了曲美替尼治疗，初始剂量为0.4 mg/d(每次0.025 mg/kg)，经过规律治疗4个月后患儿的血小板减少和肺功能都得到了改善，患儿只出现了轻度不良反应。通过在体外建立NRAS突变的KLA模型，他们发现应用曲美替尼后RAS-MAPK和PI3K-AKT-mTOR通路的过度激活得到了抑制，淋巴管内皮细胞的过度增殖也有所下降。

    七、总结与展望

    目前KLA的遗传学和临床诊疗方面的研究都有一定的进展，但由于病例较少，分子机制研究仍不够深入，相关的信号通路和其中具体涉及的分子仍不明了。但目前的遗传学研究进展给今后更深入的研究提供了启示：(1)目前在KLA中报道较多的NRAS基因突变在其他一些更为常见的肿瘤中也有发现，一些针对其下游信号通路的靶向抑制剂也已经获得FDA批准投入了临床使用，这些靶向药物在未来或许也可用于KLA的临床治疗中；(2)目前发现的一些与KLA相关的突变，可以针对其所涉及的信号通路进行进一步的体内外实验，以探明通路所涉及的分子在未来是否可用于KLA的治疗；(3)KLA被归类为GLA的一种侵袭性亚型，目前在GLA中报道较多的突变为PIK3CA基因突变，不同的基因突变类型或许可作为二者鉴别的依据。总之，目前仍需要更多的基础实验来探明KLA的遗传学发病机制。在遗传学研究的基础上研究相关基因突变与患者临床表现和病程之间的联系，实现早期诊断早期治疗，并进一步寻找精确的治疗靶点，探索KLA的新型治疗方法。

参考文献

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第十四期内容

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下动脉穿支皮瓣乳房再造

卡波西样血管内皮瘤及丛状血管瘤的药物治疗：单组率的meta分析

卡波西样血管内皮瘤体外血管生成三维模型的建立

卡波西样血管内皮瘤与丛状血管瘤临床对比研究