动静脉畸形及相关综合征遗传学精准靶向治疗

    动静脉畸形(arteriovenous malformation, AVM)占所有血管异常疾病的4.7%[ 1 ]，是血管畸形中最为凶险的一类。AVM是由于胚胎期脉管系统发育异常而导致动脉和静脉之间产生异常直接连接，缺少正常的高阻力毛细血管床。AVM病情通常进行性加重，病变可累及身体任何部位。病灶持续进展可导致周围组织破坏并伴随疼痛、致命性出血、严重外观畸形，甚至心脏功能障碍[ 2 ]。AVM的常规治疗手段作用有限，传统的栓塞和外科手术切除后病灶通常会再次扩张，1年内复发率大于90%[ 3 ]。深入研究AVM的遗传学及相关蛋白在疾病发生、发展中的具体作用及机制，有助于揭示致病机制的全貌，为精准靶向药物治疗提供潜在靶点。因此，本文对脑动静脉畸形(brain arteriovenous malformations, bAVM)、颅外AVM和AVM相关综合征进行总结，介绍最新的AVM相关遗传学与病理机制，并以此为基础探寻潜在的靶向治疗方案。AVM也可作为混合型脉管畸形的某一成分存在，但在遗传学领域，并未发现区别于单发AVM的特异性基因突变。因此，散发的包含AVM成分的混合型脉管畸形不在本文总结范围之内。

     一、bAVM

    bAVM可先天性或散发性发病，患病率为15/10万[ 4 ]。bAVM为脑血管系统中动脉和静脉之间绕过毛细血管网络的异常连接[ 5 ]，造成病灶渗漏和破裂是导致青少年脑出血和出血性脑卒中的主要原因[ 6 ]。目前的治疗手段有手术切除、血管内栓塞术或立体定向放射外科手术，但具有潜在的高风险和高复发率[ 7 ]。对于因现有疗法的高风险而无法接受治疗的患者，亟需寻找一种安全有效的全新治疗方法。精准靶向药物治疗可能颇具前景[ 8 ]。bAVM的遗传学研究加深了对bAVM分子生物学层面发病机制的了解，将为未来精准靶向治疗提供理论基础[ 9 ]。

    大多数散发性、非家族性bAVM的组织样本中都存在体细胞Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homologue, KRAS)激活突变，最常见的是G12D和G12V[ 7 ]。一项研究报道，72例bAVM患者中有45例病灶内皮细胞中检出KRAS突变[ 10 ]，并在体外实验中发现内皮细胞KRAS突变(KRASG12V)会诱导细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2)磷酸化水平增加，ERK活性增强，血管生成基因[如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)-A/C]和Notch信号通路基因表达增加。然而，蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)或p38磷酸化水平却没有增加。抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路消除了KRASG12V诱导的基因特征，但抑制磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase, PI3K)通路则无效。这表明KRAS突变特异性激活内皮细胞中的MAPK通路。此外有研究表明，KRAS突变(G12V或G12D)足以驱动AVM的形成[ 11 ]。在小鼠和斑马鱼模型中，活跃的KRAS信号导致内皮细胞形态发生改变、细胞体积增加、异位发芽、血管腔直径扩大及动脉和静脉之间的瘘形成。在斑马鱼模型中，MAP-细胞外信号调节激酶1(MAP-extracellular signal-regulated kinase 1, MEK1)抑制剂可以阻止甚至逆转动静脉分流，一定程度上挽救了脑出血[ 12 ]。当前在缺乏KRAS抑制剂的情况下，用于癌症治疗的MEK抑制剂是一种有前途的治疗bAVM治疗策略。除KRAS突变外，Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1(v-raf murine sarcoma viral oncogene homologue B1, BRAF)突变(V600E、Q636X)也有报道[ 13 ]。在一项荟萃分析中，BRAF突变在脑AVM中的发生率为7.5%[ 14 ]。其通路同质性也支持使用RAS/RAF/MAPK通路抑制剂开发靶向治疗。

    非侵入性药物治疗策略的发展也依赖于确定介导关键血管生成过程的因素。与正常脑内皮细胞相比，bAVM内皮细胞增殖迁移更快，并形成无组织的小管。先前的研究表明VEGF-A在bAVM进展中具有重要作用。在手术切除的bAVM标本细胞中发现VEGF-A表达增加，可能是信号干预的目标[ 15 ]。在利用激活素受体样激酶1(activin receptor-like kinase 1, ALK1)基因缺失结合VEGF刺激开发的成年小鼠bAVM模型中，贝伐单抗(bevacizumab)可抑制VEGF诱导的小鼠脑血管生成，降低了小鼠bAVM模型中的血管密度和发育不良血管的数量[ 16 ]。这表明抗VEGF策略可能是bAVM药物治疗的潜在疗法，但仍需进一步研究证实。与之相反的是，血管抑制因子血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1, TSP-1)在bAVM内皮细胞中显著下调。将TSP-1添加到AVM内皮细胞培养物中可使增殖和迁移率及小管形成效率正常化[ 17 ]。总之，bAVM内皮细胞中VEGF表达增加而TSP-1表达减少。小分子核糖核酸(microRNA, miR)-18a可通过降低纤溶酶原激活剂抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)水平来增加TSP-1并降低VEGF，使bAVM内皮细胞功能和表型正常化。此外，miR-18a降低骨形态发生蛋白-4(bone morphogenetic protein, BMP4)和缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的表达，阻断BMP4/ALK2/ALK1/ALK5和Notch信号通路。miR-18a还减少了异常的bAVM内皮细胞侵袭性，减少了脑血管系统的异常。miR-18a作为一种有效的无创治疗方式在预防、减少和逆转AVM方面具有潜在的临床应用空间。

    其他参与血管生成和重塑的基因在AVM血管中也被上调。Notch信号是动静脉分化的关键遗传介质，作为细胞间信号通路发挥作用，涉及多器官系统，包括血管生成、动静脉规范和血管重塑。研究发现Notch1、Notch 4及参与Notch信号传导的蛋白质在人bAVM血管内皮中上调，但在大脑其他区域的血管中没有出现上调[ 18 ]。Notch激活可能是bAVM发展的关键调节因素[ 19 ]。在新生小鼠模型中发现，Notch4(int3)激活型小鼠在3周龄出现脑动静脉分流和血管增大等bAVM的特征性表现，并在5周龄死亡；25%的小鼠显示出神经功能障碍的迹象，包括共济失调和癫痫；受影响的小鼠表现出Notch1上调，内源性水平的Notch信号传导增加[ 20 ]。这意味着激活Notch信号转导是bAVM的潜在分子机制。抑制int3可抑制共济失调并逆转了疾病进展[ 21 ]，靶向Notch通路可能是治疗AVM等疾病的潜在途径。此外，正常大脑内不存在的细胞内脂质伴侣脂肪酸结合蛋白4(fatty acid-binding protein, FABP4)也在bAVM内皮细胞中出现。

    在bAVM血管中也观察到明显的动脉或静脉特征紊乱，这可能与bAVM的形成、进展和破裂过程有关。动脉和静脉祖细胞分别表达EphrinB2和Ephrin B型受体4(Ephrin type-B receptor 4, EphB4)。Ephrin B2与EphB4的结合传导正向和反向信号，是血管生成过程中动脉和静脉之间形成连接的基础。患者bAVM切除标本的血管免疫组化分析显示，bAVM组织中EphrinB2表达增加，且EphrinB2∶EphB4比率增加。这提示EphrinB2∶EphB4信号级联的失调和EphrinB2的增加可能在AVM进展中发挥作用，这在诊断和治疗AVM方面具有潜在用途。

    二、颅外AVM

    颅外AVM是一种散发性、非遗传性血管畸形。与AVM相关的体细胞突变的研究报道，为利用现有靶向疗法对个体实施精准化治疗奠定了理论基础。引入靶向药物治疗将改变AVM的治疗概念，未来需要进行良好控制的大规模研究来确定药物治疗的有效性、安全性、最佳剂量和持续时间。

    丝分裂原激活蛋白激酶1(mitogen activated protein kinase kinase 1, MAP2K1)体细胞突变是颅外AVM的常见病因。一项研究中，25例颅外AVM患者的病灶组织样本中有16例出现有MAP2K1体细胞突变[ 22 ]。MAP2K1基因编码MEK1，在控制细胞和发育过程的RAS/RAF/MAPK信号通路中发挥重要作用。在AVM中MAP2K1突变能增强MEK1的活性，过度激活下游MAPK信号传导，引起内皮细胞功能紊乱形成异常的血管通道，导致发育中的动脉和静脉之间的毛细血管网络异常。目前，MEK1抑制剂已用于治疗各种癌症，是治疗颅外AVM的潜在药物。目前研究表明，MEK抑制剂曲美替尼(Trametinib)能降低AVM患者MAP2K1突变细胞中ERK1/2的磷酸化，并抑制内皮细胞血管网络的形成[ 23 ]。使用MAP2K1抑制剂治疗AVM有望会阻止AVM病灶的形成或进展。一项研究中，携带MAP2K1突变的11岁AVM患儿在接受6个月的曲美替尼治疗后，AVM病灶体积减小、皮温减低、皮肤颜色改善，磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)证实AVM病灶总体积与脉管口径显著减小[ 24 ]。

    "非典型"AVM更多由体细胞KRAS、HRAS变异引起[ 25 ]。携带HRAS突变的AVM患者具有脂肪细胞过度生长的倾向[ 26 ]。使用曲美替尼对Cobb综合征中KRAS突变的脊髓AVM患者进行靶向治疗，使用MRI血管造影监测治疗反应，曲美替尼治疗后AVM病灶血流量显著减少，6个月后，动脉流入量减少了75%[ 27 ]。BRAF同属RAS/RAF/MAPK信号通路，BRAF突变(V600E)较为罕见，在脊髓、皮肤AVM患者中有报道[ 28 ]。在斑马鱼模型中，使用抗癌BRAF抑制剂罗非替尼进行治疗2 d，几乎所有斑马鱼血流量都得到改善[ 25 ]。

    AVM靶向药物疗法的推进，需要奠定分子诊断基础。一项研究对血管畸形患者进行基于无细胞DNA(cell-free DNA, cfDNA)的分子诊断研究，在颅外AVM(2/8)患者的血浆cfDNA中检测到MAP2K1突变，这为患者提供了在手术前接受靶向药物治疗的机会[ 29 ]。

     三、AVM相关综合征

    目前已知4种包涵AVM的遗传性综合征，分别是遗传性出血性毛细血管扩张症(hereditary hemorrhagic tyelangiectasia, HHT)、毛细血管畸形-动静脉畸形综合征(capillary malformation-arteriovenous malformation, CM-AVM)、张力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)肿瘤错构瘤综合征(PTEN hamartoma tumor syndrome, PHTS)和Parks-Weber综合征(Parkes Weber syndrome，PWS)。他们由不同的基因突变而影响不同分子途径，导致AVM症状。

    (一)HHT

    HHT，又称为Rendu-Osler-Weber综合征，是一种常染色体显性遗传性疾病，患病率约为1/8 000[ 30 ]。其特征是皮肤和黏膜毛细血管扩张，并伴有多个器官AVM，可导致中风、脑脓肿、高输出心力衰竭等威胁生命的症状[ 31 ]。至少20%的HHT患者因胃肠道毛细血管扩张出现慢性出血，鼻出血也是常见症状。HHT具有遗传异质性，可由ENG(HHT1)、ACVRL1(HHT2)、SMAD4 (HHT3)、BMP-9或GDF2突变引起，其中约90%的病例与ENG或ACVRL1基因的杂合突变有关。这些突变基因编码蛋白质均属于转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族信号通路[ 19 ]。在TGF-β家族中，BMP9和BMP10显示出与ALK1和内皮糖蛋白直接结合的高亲和力[ 32 ]。配体与细胞表面受体BMP9/10结合后，信号通过ALK1的磷酸化、Smad 1/5/9的磷酸化、Smad复合物易位传导到细胞核对靶基因的转录作用进行调控。BMP9/10-ALK1-Smad1/5/9信号通路通过抑制促血管生成的VEGF和血管生成素2(angiopoiet2, ANGPT2)信号通路来维持血管稳态[ 33 ]。HHT患者中，编码该信号传导通路的基因发生致病突变造成功能丧失，导致下游信号传导减少，VEGF和ANGPT2信号传导途径活性增加，促进血管生成。

    目前，HHT的诊断主要依赖临床表现，开发早期诊断的生物标志物具有广泛的应用前景。近期研究表明，血浆miRNA-370水平在HHT1中下调，但在HHT2患者中未下调；血浆miRNA-10a水平在HHT2中增加，但在HHT1患者中没有增加[ 34 ]。HHT患者循环血浆中的miRNA-370或miRNA-10a水平失调是潜在的生物标志物，可分别帮助识别未确诊的HHT1或HHT2患者。

    以往，HHT的治疗旨在减轻疾病症状，尚未有基于机制的靶向治疗。近年来，两类药物治疗策略取得进展：一类是癌症治疗中使用的抗血管生成药物，如VEGF抗体(贝伐单抗)或血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)酪氨酸激酶抑制剂(如帕唑帕尼)，其作用是平衡HHT中过度激活的促血管生成过程。另一类药物是基于HHT的机制进行高通量筛选所得的药物，他克莫司和西罗莫司(又名雷帕霉素)是通过高通量筛选确定的ALK1信号激活剂。据报道，西罗莫司和VEGFR抑制剂尼达尼布(Nintedanib)联合用药可逆转BMP9/BMP10免疫敲除小鼠的视网膜AVM，并预防了成年AlK诱导HHT小鼠模型的胃肠道出血和贫血[ 35 ]。

    (二)CM-AVM

    CM-AVM是一种罕见的常染色体显性遗传病，患病率约为1/10万。临床症状轻者可仅表现为多发性非典型性红斑，大部分位于面部和四肢；但另约1/3的患者合并严重的AVM和(或)动静脉瘘，通常在皮肤、肌肉、骨骼、脊柱和大脑中出现高流量血管畸形，可导致出血、充血性心力衰竭和神经系统后果，危及生命。常规的介入手段和外科手术治疗CM-AVM的效果较差，且潜在风险大，亟需寻找新的治疗方案。

    有研究表明，约有50%的CM-AVM患者携带RASA-1基因杂合缺失突变(CM-AVM1)[ 36 ]。RASA-1基因编码位于细胞质的RAS p21蛋白激活剂1，又称为p120 Ras GTP酶激活蛋白(p120 Ras GTPase activating protein, p120RasGAP)。该蛋白属于GAP1家族，在脑、肌肉和胎盘等人体组织中广泛表达，可通过激活RAS p21的GTP酶，将活性的Ras-GTP转化为非活性的GDP结合形式，从而抑制RAS/MEK/ERK信号通路转导[ 37 ]。此外，约25%的患者携带EphB4基因突变(CM-AVM2)[ 38 ]。EphB4是Eph跨膜受体酪氨酸激酶超家族成员，在血管发育过程中，EphB4在静脉内皮细胞中表达。EphB4与其同源配体Ephrin B2结合(主要在动脉内皮上表达)，EphB4-Ephrin B2相互作用对于血管重塑、毛细血管床的正确形态发生、血管发生至关重要。EphB4及其配体EphrinB2与Notch信号协同发挥作用，抑制RAS/MEK/ERK信号通路，以调控动静脉分化[ 39 ]。

    有研究者提出CM-AVM致病的"二次打击"假说，认为CM-AVM患者中以RASA-1基因种系突变为前提，在病灶组织细胞的等位基因处出现体细胞突变，使得RASA-1基因的一对等位基因完全失活[ 40 ]。RASA-1的体细胞"第二次打击"失活突变被认为是疾病发展所必需，因为大多数RASA-1突变导致单倍体功能不足，直到发生"二次打击"的体细胞突变，才会出现AVM病变表现。一项家系调查研究中，在先证者及其家族亲属的血样中检测到RASA-1第5外显子c.1015dupG, p．Val339fs的种系突变，并在先证者浅层及深层结缔组织中检测到RASA-1第16外显子的c.2035C>T, p．Arg679*体细胞第二突变，支持了CM-AVM致病机制的二次打击学说[ 41 ]。这也解释了为何CM-AVM患者会出现程度不同的高流速脉管畸形。

    总而言之，作为RAS蛋白的负调节剂，RASA-1基因和EphB4基因的突变都会引起下游RAS/MEK/ERK信号通路的异常激活，导致异常的细胞增殖和血管增生，导致CM-AVM的发生。因此靶向抑制RAS/MEK/ERK信号通路，有望成为CM-AVM的潜在药物靶点。

     (三)PTHS

    PTHS是一种罕见的先天性常染色体显性遗传疾病，又称为Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征，临床特征为巨头、肌张力减退、多发性皮肤血管脂肪瘤、血管畸形、肠息肉及阴茎色素斑。在家系和散发的患者中均发现第10号染色体缺失的磷酸酶及PTEN的突变。PTEN是众所周知的抑癌基因，参与人类脑癌、乳腺癌和前列腺癌的发病机制。PTEN(磷酸酶和张力蛋白同源物)编码一种双重特异性磷酸酶，可特异性去磷酸化磷脂酰肌醇三磷酸以拮抗PI3K的作用，参与PI3K/AKT/mTOR途径的负调节，介导细胞周期停滞和细胞凋亡[ 42 ]。PTEN突变失活导致PI3K水平升高，持续刺激PI3K/AKT/mTOR通路，导致内皮增殖和血管生成异常。此外，PTEN能抑制MAPK途径上游中ERK、RAS的活化以及接头蛋白的Shc磷酸化[ 43 , 44 , 45 ]，从而对MAPK/ERK信号途径起负调控作用，从而抑制有丝分裂信号向胞核传导，阻止细胞生长及促进凋亡。PTEN突变导致MAPK/ERK的异常激活，引起细胞异常增殖，是其发病机制。

    在对26例PTEN突变患者的回顾性研究中，54%的PHTS患者有AVM[ 46 ]。西罗莫司(雷帕霉素)是哺乳动物雷帕霉素靶标的抑制剂，被证明可有效治疗PTEN突变患者的复杂AVM，但具体机制仍需进一步研究[ 47 ]。

    (四)PWS

    PWS又称为血管扩张性肥大综合征，是一种复杂的先天性血管畸形综合征，由Weber于1907年首次报道。其特征是多个微动静脉瘘和软组织和骨骼成分的节段性过度生长，临床表现为患肢肥大、浅静脉曲张、皮肤血管痣，并伴动静脉瘘[ 48 ]。PWS患者预后较差，高流量血管病变使得患者在成年早期便面临充血性心力衰竭或肢体缺血的风险。

    PWS通常被描述为散发性。有研究报道了PWS的家族性观察，1例诊断为PWS的男性患儿，其堂兄比他大10岁，也患有右上肢的PWS[ 49 ]。此外，研究表明PWS与常染色体显性遗传有关，其致病基因尚未明确。PWS可能由RASA1基因的种系杂合失活突变引起[ 50 ]。在一项研究中，16例先证者中有13例(81%)具有PWS表型并被鉴定出RASA1突变[ 46 , 47 ]。PWS的家族内变异性和涉及软组织、内皮和骨骼的节段性过度生长的多灶性病变，强烈提示体细胞二次打击模型是疾病发展所必需的[ 40 ]。一项临床研究报道了1例2岁PWS患儿，其病灶组织的体细胞检测显示有2种RASA1致病突变：c.934_938del, p．(Glu312Argfs*14)和c．2925del, p．(Asn976Metfs*20)[ 51 ]，一定程度上支持了这一假说。此外，在1例PWS婴儿的皮肤活检组织中，也检出了MAP2K1突变[ 52 ]。MAP2K1突变也在颅外AVM中检出，该突变的鉴定为未来患者接受MEK抑制剂药物治疗提供了潜在的理论基础。

    四、展望

    AVM是最为凶险、最难处理的血管畸形类型。尽管已有多种治疗方法，然而由于其高复发率和致命并发症，AVM及合并AVM的综合征的治疗仍然是临床面临的巨大挑战[ 53 ]。靶向药物为此类困难疾病提供了全新的治疗策略，尤其是对因手术、介入手段风险高而无法接受治疗的患者提供了新的治疗选择，这将会成为本领域持续的研究热点。

    明晰AVM的致病基因、通路改变和病理生理学特征，将为确定潜在的治疗靶点、精准靶向AVM提供理论依据。目前研究显示，在大多数情况下，AVM更多由RAS/RAF/MAPK和TGF-β信号通路异常引起，而受PI3K/AKT通路影响较小。后者主要在低流量血管畸形中起作用。靶向RAS/RAF/MAPK通路或TGF通路是具有前景的治疗方向。值得一提的是，在RAS/MEK/ERK通路的靶向药物中，MEK抑制剂的研发已较为成熟，已上市应用于肺癌、结直肠癌等恶性肿瘤和神经纤维瘤等良性肿瘤中，具有较好的疗效[ 54 ]。

    未来需要开展深入的基础研究以进一步了解AVM形成的详细机制并指导改进治疗策略。当下类器官模型、高通量测序、计算机模拟等新兴技术的蓬勃发展会加速我们对AVM分子细胞缺陷的理解。结合手术、血管内栓塞、药物治疗等的多学科治疗，将基础科学发现转化为临床策略也是改善AVM患者治疗和预后的的关键。

参考文献

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第十四期内容

乳房再造手术时机、分期名词规范和双血管蒂腹壁

下动脉穿支皮瓣乳房再造

毛细血管畸形-动静脉畸形综合征2的临床诊断及遗传学依据

颅外动静脉畸形的遗传学与靶向治疗研究进展

颅外动静脉畸形的基因学研究进展