脂肪来源干细胞及其衍生物应用于慢性难愈性创面的研究进展

    体表慢性难愈性创面俗称溃疡，也称慢性创面或慢性伤口。国际伤口愈合学会将其定义为无法通过正常、有序且及时的修复过程达到解剖和功能上完整状态的创面[ 1 ]。临床上多指由于各种原因造成的经过1个月以上正规创面治疗仍未能愈合，也无愈合倾向的创面。它是一种常见且复杂的疾病，不仅给医疗系统造成了负担，而且显著降低了患者的生活质量。干细胞治疗是一种新选择，干细胞具有自我更新和多向分化潜能，能够修复和再生以填补创面。其中，脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)由于来源广泛、易提取，给慢性创面的治疗带来新的希望。本文从创面愈合的机制入手对ADSCs及其衍生物在治疗慢性难愈性创面方面的研究进行综述。

    一、创面难愈合的细胞和分子机制

    皮肤是机体主要的防御屏障，具有自愈和自我更新能力。在健康人体中，当皮肤受到损伤时，通过分子信号和细胞行为的高度动态级联，进行急性创面修复以确保皮肤屏障快速闭合。创面的修复包括止血、炎症、增殖和成熟4个阶段：首先是启动凝血途径，血小板聚集至损伤处；为响应损伤相关分子模式，中性粒细胞、巨噬细胞趋向性迁移，清洁伤口；随着内皮细胞被广泛激活，巨噬细胞衍生的非转移性黑色素瘤糖蛋白B促进其由经典活化巨噬细胞转变为替代性活化巨噬细胞[ 2 ]，进行伤口修复和填充，p53通过p21的转录激活诱导前导细胞行为[ 3 ]，驱动上皮细胞迁移，完成伤口再上皮化；创面愈合的最后阶段是成熟期，包括胶原蛋白的交联、重塑和伤口收缩，此阶段的任何异常都可能导致创面过度愈合，或形成慢性创面。多组学分析表明，En-1(Engrailed-1)阳性的成纤维细胞是瘢痕沉积的原因，机械传导的最终转录效应子控制着En-1由阴性向阳性转化[ 4 ]。

    慢性创面难愈合的一个关键因素是存在慢性持续性炎症反应，中性粒细胞胞外陷阱通过白介素(interleukin，IL)-1α和组织蛋白酶G加强血管内皮功能障碍[ 5 ]，水解血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，而抑制新生毛细血管的形成[ 6 ]，导致巨噬细胞极化障碍，增加促炎活性并维持炎症状态，使创面处于感染、炎症和修复不充分的恶性循环中。在不愈合的慢性创面中，JNK/STAT通路中的负调节因子即细胞因子信号抑制物上调，抑制了皮肤创面上皮修复中角质形成细胞的增殖和迁移，导致创面愈合过程减慢。在糖尿病溃疡患者中还能发现高血糖通过缺氧反应途径导致新生血管受损，同时耗竭参与血管形成的干细胞群，使血管生成潜力下降，并使COX-2/PGE2通路表达增加[ 7 ]，维持创面巨噬细胞的炎症表型。导致创面延迟愈合的因素是多方面的，激素、皮肤微生物组等也发挥着重要作用( 图1 )。

    二、ADSCs对创面愈合的作用( 图1 )

    ADSCs通过2个主要机制促进创面愈合，即分化潜能和旁分泌作用。ADSCs作为间充质干细胞，具有多向分化潜能，可以分化为血管内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞和角质形成细胞，还能通过旁分泌机制分泌生物活性因子和外泌体(ADSCs-Exo)，从而调节炎症反应、血管生成、上皮再生和创面重塑。

    (一)炎症期

    调节免疫平衡、抑制炎症反应是促进慢性创面愈合的一个关键环节，ADSCs主要是通过旁分泌的方式来调节。它可以通过分泌转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、VEGF、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、胰岛素样生长因子等来调控细胞增殖和分化、血管生成和再上皮化，抑制早期炎症反应。ADSCs分泌的细胞因子可以影响炎症细胞的行为，巨噬细胞是调节炎症发生、发展和消退的关键细胞，其在单核细胞趋化蛋白1的趋化下聚集至创面，又通过肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、前列腺素E2和生长分化因子11诱导，由经典活化巨噬细胞转变为替代性活化巨噬细胞，从而抑制炎症反应。Li等[ 8 ]通过实验发现过表达Nrf2的ADSC-Exo能够下调创面NOX1、NOX4和IL-1β、IL-6、TNF-α水平，抑制活性氧和炎性细胞因子的表达，从而减轻炎症反应。ADSCs-Exo还可以通过抑制肿瘤坏死因子受体Ⅰ型相关死亡结构域蛋白(TRADD)表达，减少内皮细胞炎症反应和细胞凋亡[ 9 ]。

    (二)增殖期

    ADSCs分化为血管内皮细胞和上皮细胞有助于毛细血管的新生，增加血流量，改善创面微循环。ADSCs在体内可分化为血管内皮细胞，并明显提高其增殖和迁移能力[ 10 ]，最终促进创面组织再生和血管生成。但其内皮分化效率并不高，发挥促血管化作用的主要是其旁分泌功能，其分泌表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、FGF、VEGF、HGF和编码趋化因子受体CXCR4及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1的基因，VEGF可以促进内皮祖细胞的动员、募集和迁移，最终加速血管生成。同时，有研究发现缺氧诱导因子-1是血管生成的正调节剂，加速了糖尿病创面的愈合，缺氧时ADSCs-Exo也通过PI3K/AKT通路上调VEGF，促进创面愈合和抑制炎症反应。

    成纤维细胞和角质形成细胞在增殖期也发挥着关键作用，促进创面肉芽组织形成和再上皮化。ADSCs可以直接向成纤维细胞分化，也可以分泌VEGF、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、血小板衍生因子促进成纤维细胞迁移，分泌bFGF和EGF促进其增殖，从而形成肉芽组织填满创面。同时，ADSCs-Exo可通过激活EPK/MARK通路[ 11 ]、PI3K/Akt通路[ 12 ]、lncRNA H19/miR-19b/SOX9轴[ 13 ]促进成纤维细胞增殖、迁移和侵袭，提高Ⅲ型与Ⅰ型胶原纤维的比例及TGF-β3与TGF-β1的比例，改善皮肤成纤维细胞MMP-3的表达，促进创面愈合，同时还可通过miR-192-5p/IL-17RA/Smad轴[ 14 ]抗纤维化，减少肥厚性瘢痕的产生。Ebrahimian等[ 15 ]证实转染GTP的ADSCs能够表达角质形成细胞标志蛋白——细胞角蛋白CK5和CK14，即ADSCs可以分化为角质形成细胞。ADSCs还可以通过上调TGF-β1和纤连蛋白的表达[ 16 ]，促进角化细胞和内皮细胞的募集及创面皮肤的再上皮化。

    三、ADSCs及其衍生物在慢性难愈性创面应用中的实验研究

    (一)ADSCs移植

    ADSCs可以直接注射于创面发挥疗效。在动物实验中发现，应用ADSCs的创面愈合更明显，肉芽组织形成增加。Kallmeyer等[ 17 ]比较将ADSCs直接注射到大鼠创面和静脉注射的作用，结果发现局部注射ADSCs的创面比静脉注射愈合得更快，这可能与血液中ADSCs存活时间短有关，但在局部注射ADSCs也会因剪切应激造成细胞活力下降。

    (二)组织工程化支架皮肤构建

    直接注射ADSCs往往导致再生组织分布不均、细胞存活率低，为改善这一状况，研究人员尝试以支架为载体的组织工程方法，显著提高了ADSCs增殖、分化和旁分泌信号传导能力。许多具有生物相容性、生物降解性、低毒性等特征的生物材料，如纤维素、藻酸盐、胶原蛋白、甲壳素、透明质酸等，都已被用作支架材料。但它们仅包含细胞外基质中的单个成分，作用单一、弊端明显，因此常需要对材料进行修饰。如用儿茶酚胺修饰透明质酸水凝胶[ 18 ]能提高其黏附性、生物相容性和存活率，并与ADSCs协同促进创面愈合；添加冻干氧包封的纳米粒子来改造水凝胶，使其将氧气运输至缺氧组织[ 19 ]，可提高创面愈合比例。人工合成材料也常被复合使用，将抗氧化材料丝胶蛋白与明胶混合[ 20 ]，再用层粘连蛋白涂覆，合成三维多孔冷冻凝胶支架，保护成纤维细胞以防止自由基攻击。近年来，静电纺丝纤维支架也成为研究热点，它在结构上与细胞外基质相似。Chen等[ 21 ]开发了负载ADSCs培养液的微纳米聚乳酸静电纺丝纤维，其内还包含透明质酸纳米颗粒，能显著加速伤口闭合并促使其无瘢痕再生，迅速恢复小鼠皮肤正常外观。

    三维生物打印技术正朝着更加个性化、精准化的方向发展。目前已经开发出可以显示药物控释和创面实时监测的以天然丝胶为基础的透明水凝胶，实现了创面护理的可视化。还有许多研究人员试图在其中加入释氢材料，以向创面最深处供应氧气，支持细胞代谢，如Touri等[ 22 ]开发的三维生物打印磷酸钙支架和Lu等[ 23 ]开发的海藻酸盐打印水凝胶。

    对材料进行修饰的最终目的在于模拟天然微环境，人类脱细胞脂肪基质作为天然支架被用于ADSCs的运输，它有效地去除了细胞中免疫原性成分，剩余基质中的胶原蛋白、蛋白多糖及许多细胞因子为细胞的生长和分化提供环境[ 24 ]，结合ADSCs的脱细胞脂肪基质对全厚皮肤创面的糖尿病小鼠模型具有促进血管化、加速慢性创面愈合的作用[ 25 ]。迄今为止，脱细胞支架已被广泛作为再生医学和组织工程的生物支架来源，基于此的细胞片技术也成为研热点。Zhu等[ 26 ]提出了基于细胞片-质粒膜-细胞片的新型三明治结构来增强细胞片层和细胞活性，其优异的溶胀特性和生物降解性确保了VEGF的持续释放，从而促进新生血管的形成、创面愈合及皮肤再生，具有较高的临床转化潜力。

    (三)ADSCs衍生物的应用

   ADSCs衍生物包括血管基质组分 (stromal vascular fraction， SVF)、 ADSCs条件培养基(ADSCs-CM)、ADSCs-Exo等。SVF已经广泛用于临床，其是含有多种细胞和细胞因子的混合物，Rigotti等[ 27 ]在临床上对患者皮下注射SVF，结果发现在促进面部皮肤血管生成的同时减轻了炎症反应。而ADSCs-CM含有ADSCs分泌的活性物质，三维培养的ADSCs-CM对成纤维细胞和角质形成细胞的增殖和迁移有较好的促进作用，更有利于创面愈合。ADSCs-Exo是ADSCs分泌的细胞外囊泡，能穿透生理组织屏障，参与细胞间物质和信息的交换。ADSCs-Exo是一种无细胞疗法，因此临床转化潜力更高，将ADSCs-Exo与纳米纱线支架直接结合，在体内和体外都表现出有效促进新生血管的形成和尿道上皮再生的作用[ 28 ]。在慢性糖尿病创面大鼠模型中，由抗氧化聚氨酯冷冻凝胶组成并辅以ADSCs-Exo的敷料可有效促进血管生成、胶原蛋白重塑、肉芽组织形成和再上皮化，从而促进创面愈合[ 29 ]。

    四、总结与展望

    慢性创面涉及机制复杂、治疗过程繁复，临床中缺乏理想的治疗方法。近年来，ADSCs在此领域具有明显的优势，有关机制和临床试验也不断开展。ADSCs因其多向分化潜能和旁分泌效应，可以从促进血管生成、调节炎症反应、提高成纤维细胞增殖和迁移能力、促进上皮化等方面作用于慢性创面，同时其易获取、与胚胎干细胞相似的伦理问题较少，因此有着广阔的应用前景。目前已经开展了相当多的临床前实验和一部分临床试验，主要是关于静脉注射、脱细胞脂肪基质支架、三维生物打印技术、ADSCs衍生物等几个方面，或与其他治疗创面的方式联合应用，均取得了很好的效果。虽然相当一部分研究仍处于动物实验阶段，但其在再生医学领域的潜力及优势已经日趋明显。然而干细胞的应用面临着分化效率低、安全性无法保障等问题。有研究者提出，脂肪移植可能为原发性肿瘤发生和肿瘤转移提供了一条途径。在体外实验中发现ADSCs显著增加了乳腺癌和头颈癌细胞系的细胞增殖、迁移和侵袭潜能[ 30 , 31 , 32 ]，但临床研究却未发现肿瘤复发风险增加的现象，这表明体内存在着更为复杂的生理机制。此外，ADSCs在体内发挥作用的特异性蛋白和非编码RNA仍需要进一步进行质谱、测序和筛选，这都是我们在未来的很长一段时间需要解决的问题。

参考文献

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第十四期内容

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