文献分享：Ⅲ型胶原蛋白 VS. 透明质酸 - 血管栓塞的实验探秘

总第 1129期

医美前沿（ID：yimeimarketing)

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近年来，美容外科领域广泛使用软组织填充剂，成为整形外科医生常见的微创手术之一，这一趋势在全球范围内持续增长。特别是透明质酸（HA）填充剂备受推崇，因为它们操作简便、效果显著、恢复迅速，并伴随较低的并发症率。然而，与其广泛应用相关的问题是HA填充剂可能引发严重的血管栓塞并发症，如皮肤坏死和失明。虽然已经进行了一些研究，但迄今尚未有针对HA和其他可注射填充剂的全面比较，特别是与新型的重组Ⅲ型胶原植入物相比。本研究采用兔子动物模型，通过观察血流动力学变化、皮肤坏死程度和组织病理学变化，旨在明确HA与胶原在引发血管栓塞风险方面的差异。研究者期望通过这项研究揭示填充剂之间的潜在风险差异，为美容外科实践提供重要参考。 

2 | 材料与方法

2.1 | 研究动物和研究产品

本研究采用了50只健康的白色兔子（2.96 ± 0.21千克），这些兔子的耳朵需要完整无损，耳部血管无明显畸形。兔子被单独放置在编号的金属笼子中，并在动物实验中心进行管理。它们享有充足的食物和水，生活在自然光线下，环境温度和湿度得到适宜的控制。在实验中，研究者采用肌肉注射方式，使用联合制剂哌嗪 + 索利替尔进行麻醉，麻醉剂量为0.8毫升/千克。实验兔子在注射后的第七天进行仔细观察和拍照，随后使用CO2过量吸入法实施安乐死。在安乐死过程中，兔子首先被麻醉，然后置于装有过量二氧化碳的设备中。实验中使用的测试产品包括重组Ⅲ型胶原填充剂（江苏特乐医疗技术有限公司）和透明质酸（Restylane；Q-Med）。

2.2 | 血管内栓塞的动物模型

按照随机对照方法，将实验动物分为五组（C1、C2、C3、C4和HA），每组有20只兔耳。各组的标识如下：C1组：以均匀速度将0.2毫升的胶原注射到中耳中动脉内，注射时间为60秒。C2组：以均匀速度将0.3毫升的胶原注射到中耳中动脉内，注射时间为60秒。C3组：以均匀速度将0.2毫升的胶原注射到中耳中动脉内，注射时间为30秒。C4组：以均匀速度将0.3毫升的胶原注射到中耳中动脉内，注射时间为30秒。HA组：以均匀速度将0.1毫升的透明质酸注射到中耳中动脉内，注射时间为60秒。麻醉采用哌嗪 + 索利替尔（1:1）的联合注射，剂量为0.8毫升/千克。兔耳的背部和腹部毛发在麻醉后被剃掉，然后使用明亮的光照明兔耳的腹面，以清晰地区分主要血管的走向。注射采用27G注射针（0.5毫米），以均匀速度将填充剂注射到中耳中动脉的主干中，注射点位于动脉主干与侧支分叉点的下游5毫米处。所有注射由经验丰富的整形外科医生进行，正式实验之前已进行了练习。在注射过程中，助手每5秒通知医生，以确保注射的最大均匀性。

2.3 | 血管内血流动力学变化和皮肤坏死的观察

研究者设定了一系列观察时间点，包括注射前、注射后立即、注射后5分钟、注射后30分钟、注射后1天和注射后7天。在这些时间点，仔细观察并用高清相机记录兔耳血管的血流动力学变化和皮肤坏死情况。主要观察指标包括血管再通和皮肤坏死程度，评估标准参照表1和表2。这些评估由两位资深整形外科医生进行，若出现意见不一致的情况，会邀请第三位整形外科医生进行讨论和判定。

（表1）

（表2）

2.4 | 组织学检查

在注射后的第7天，我们观察、记录并拍摄了每只兔耳的近端、中部和远端部分，然后将这些部分固定在4%甲醛中。接着，我们将液体石蜡加入模具中，将待嵌入的组织样本浸入石蜡中，以确保组织位置正确。随后，我们补充了少量液体石蜡，然后进行冷却和冷冻，使石蜡凝固以固定组织。然后，我们使用显微切片机将组织切割成约4-8微米的厚度。这些组织切片被放置在载玻片上，浸泡在40°C的温水中，以使组织充分拉伸。接下来，我们进行了脱蜡和脱水处理，并使用伊红染色、分化和蓝色处理，然后清洗并用苏木精染色，最后进行脱水处理。经过这些处理后，组织样本被空气干燥，然后密封，以供显微镜观察和拍摄。

2.5 | 统计分析

我们使用IBM Corp.提供的SPSS 16.0软件包进行统计分析。对于偏斜分布的测量数据，我们采用中位数（四分位数）[M（Q1，Q3）]，而对于计数数据，我们使用百分比（%）。我们使用独立样本的非参数检验和卡方检验来比较和分析每个组的测量值。统计显著性水平设定为p = 0.05。 

3 | 结果

3.1 | 胶原和透明质酸在动脉内注射对血管再通的影响

在C1组，注射后共有15只兔子显示出注射部位出血，19只兔子在注射后5分钟内在注射部位出现血肿。然而，在HA组中，只有一只兔子在注射部位出现出血，九只兔子在5分钟内出现血肿（图1B，视频S2）。这结果表明，HA倾向于阻塞注射部位附近的血管，使血流难以通过。相反，当胶原进入血管时，注射部位附近的血管不容易完全阻塞，血液仍然通过血管破口流出。

（图1）

注射后30分钟，C1、C2、C3和C4组分别有17、16、17和16只兔子的中耳中动脉完全再通，而HA组没有兔子的中耳中动脉再通。注射后第1天，所有胶原组的兔子中耳中动脉主干完全再通，没有出现栓子。然而，HA组中只有一半的兔子在这一天内中耳中动脉完全再通。未再通的兔子耳部中耳中动脉内出现了栓子。注射后第7天，HA组中仍有1/5的兔子中耳中动脉未再通。总之，在分析注射后各组在5分钟、30分钟和1天后的血管再通情况时，C1组与HA组之间存在显著差异（p < 0.05）。然而，C1、C2、C3和C4组之间没有显著差异（p > 0.05）。在注射后第7天各组之间的血管再通情况也没有显著差异（p > 0.05）。在当前的实验条件下，胶原的注射剂量和注射速度未导致血管再通存在显著差异（图2-4）。

（图2）

（图3）

（图4）

各组兔子注射后5分钟、30分钟、1天和7天后的中耳中动脉再通情况见图5。

（图5）

3.2 | 胶原和透明质酸注射对皮肤损伤的影响

在注射后第7天，不同的皮肤损伤状况在各组之间观察到。几乎所有HA组的兔耳都表现出中度到重度的皮肤坏死（19/20）（图4），而在注射持续时间相同且注射剂量更大的C1组中，没有发生皮肤坏死。在C1组中，17/20只兔子的耳朵完全正常，而3/20只兔子的耳朵表现出轻度可恢复的皮肤损伤（图1D和2）。两组之间的皮肤坏死也存在显著差异（p < 0.05）。与HA相比，胶原不太可能引起严重的皮肤坏死，并且在某些情况下会出现可逆的轻度皮肤损伤。另一方面，四个组C1、C2、C3和C4之间的皮肤损伤程度没有显著差异（p > 0.05）。在当前的实验条件下，胶原注射剂量和注射速度对皮肤坏死的影响也没有显著差异。

3.3 | 注射后第7天的组织病理学变化

在注射后第七天，我们收集了局部兔耳组织进行HE染色，以观察组织病理学变化。正常的兔耳区域显示具有完整的皮肤组织结构，没有炎症或血管内异物。暗淡的皮肤区域显示有完整的组织结构，血管充血，炎症细胞浸润，偶尔可见少量血管内充填物。中度到重度皮肤损伤部位显示出炎症和无结构的组织坏死。在注射部位观察到大量充填物和血细胞聚集（图6）。

4 | 讨论

动脉栓塞被认为是填充剂应用引起的最危险和严重的并发症之一。事实上，血管并发症的发生频率比我们以前所认为的更高。一项全球范围内对52名经验丰富的注射者的调查发现，其中有62%的人报告曾经遇到一种或多种血管并发症。血管栓塞通常导致严重后果，如皮肤坏死和失明。不幸的是，目前治疗血管栓塞的方法非常有限。因此，了解解剖学和注射技术对于预防血管并发症至关重要。填充剂的选择也直接影响血管并发症的风险。一项文献的元分析发现，与胶原相比，透明质酸引发的血管栓塞病例要多得多。这一现象可能有多种解释：（1）透明质酸颗粒较大，具有较高的亲水性和粘度，因此更容易引起近端血管阻塞；（2）一些研究表明，这两种填充物通过不同的机制导致局部缺血，胶原可能引发炎症反应和凝血系统激活，而透明质酸主要通过机械阻塞动脉血供。需要注意的是，透明质酸的全球使用率远高于胶原，因此报告的并发症也更为常见。

Ⅰ型和Ⅲ型胶原在皮肤组织中广泛存在，特别是在真皮中。以前的研究发现，胚胎真皮中含有约50%的Ⅲ型胶原，但这一比例在出生后的生长过程中下降到约15%。Ⅰ型胶原是粗纤维，通常被认为是皮肤机械强度的结构支架。Ⅲ型胶原则属于微小纤维，为皮肤提供弹性。与Ⅰ型胶原相比，Ⅲ型胶原的注射可以使皮肤更接近其年轻状态，提供弹性支持和轮廓。为了验证填充剂的物理性质与动脉栓塞风险之间的关系，本研究采用了兔耳作为模型，因为兔耳具有薄的皮肤和浅分布的血管，这有助于观察血管栓塞。在注射胶原时，我们观察到在注射几秒钟后，注射部位出现了明显的出血，无论是在0.2 mL组还是0.3 mL组。然而，相反，在注射0.1 mL Restylane后，血管明显被阻塞，30分钟内没有出血，基本上没有再通。这一结果证实了小颗粒和低粘度的胶原进入血管时具有不同的血管栓塞风险。与此相反，透明质酸的血管栓塞率明显高于胶原。在第1天，透明质酸组的血管栓塞率明显高于胶原组，但随着时间的推移，胶原组的再通率也逐渐增加，而透明质酸组的再通率则下降。此外，透明质酸组的皮肤坏死风险明显更高。总的来说，不同的填充剂在进入血管时具有不同的血管栓塞风险。Restylane的血管并发症发生率和严重程度更高，而胶原的安全性更好。

注射剂量与血管并发症的发生密切相关。最严重的血管栓塞病例通常发生在高剂量填充剂注射中。专家一致建议，应采用小剂量多点注射的方式进行注射，以确保针头连续移动，从而减少血管栓塞的风险。已发表的研究证实，在兔耳中央动脉注射0.2 mL透明质酸的组中，与注射0.1 mL的组相比，后者具有更高的血管并发症和皮肤坏死发生率。我们的研究也发现，在将Ⅲ型重组胶原注射到兔耳中央动脉时，0.2 mL组和0.3 mL组之间在血管并发症和皮肤损伤发生率方面没有显著差异。此外，在相同的注射速度下，30秒组和60秒组之间在各种胶原注射剂量的血管并发症和皮肤损伤发生率之间也没有显著差异。这表明，注射速度可能不是血管栓塞发展的关键因素。需要注意的是，快速注射产生的高压力可能导致填充物通过血管破口进入血管外，从而引发血管栓塞。在这个实验模型中，填充物直接注入血管。此外，快速注射产生的高压力鼓励填充物分散到更远的血管分支，使其更容易进行逆行输送。总之，我们证实了Ⅲ型重组胶原和Restylane之间存在血管并发症风险的差异，以及不同剂量和注射时间对血管并发症风险的影响。在可注射的填充剂引起的血管并发症方面，胶原的安全性比透明质酸更高。

然而，透明质酸在免疫反应方面可能比胶原更为安全。值得注意的是，我们的研究是基于兔耳血管栓塞模型的动物实验，因此无法完全模拟导致失明的眼动脉栓塞。这需要建立新的动物模型。此外，将这些研究结果转化为人类临床仍然具有不确定性和挑战性。因此，需要进一步的临床试验来验证Ⅲ型重组胶原的安全性。最后，我们建议在实际的临床注射中注意以下四个方面：（1）选择合适的可注射填充剂；（2）选择合适的注射部位和组织层面；（3）采用多点小剂量注射的策略；（4）缓慢均匀注射，以减少高压力注射可能导致的风险。这些建议可以帮助降低血管并发症的风险，提高填充剂应用的安全性。

Feference：Sun Y, Nie F, Wang G, Li Q, Xie H. Anexperimental study of the vascular embolism caused byrecombinant type III collagen implants and hyaluronic acid. JCosmet Dermatol. 2023;22:2705-2713. doi:10.1111/jocd.1576914732165, 2023, 10, Downloaded from https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jocd.15769 

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