文献分享 ｜ 射频微针和肉毒素隔几天打，才能保证最佳效果？

总第 1135期

医美前沿（ID：yimeimarketing)

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1 | 引言

肉毒杆菌毒素A型（保妥适）是临床实践中最广泛使用的生物毒素之一。它通过抑制神经肌肉接头（NMJ）释放乙酰胆碱来削弱肌肉收缩，导致局部无力和麻痹。目前，人们对自我形象有着更高的需求，保妥适在美容医学中的作用也日益突出。保妥适注射目前是最有效的非手术治疗方法，可以改善面部动态皱纹，显著提升人们的外貌、社交心理、自信，并减轻焦虑。

不断增加的对减少面部皱纹和松弛的美容治疗需求，推动了寻求更有效的非手术技术。保妥适与各种能量设备的联合治疗受益良多，因为这些治疗针对面部不同区域并相互补充，表现出卓越的美容效果和更高的患者满意度。

目前，所有临床医生都同意将保妥适和能量设备结合治疗的理念更有效。但是，如何最佳地结合这两种治疗方法仍然是一个难以解决的问题，以及能量设备的热效应是否会影响肉毒杆菌毒素的活性也仍然存在疑问。考虑到患者的安全和康复，临床医生通常建议保妥适注射应在能量设备治疗后1周进行。

微针射频治疗仪是一种逐渐发展的微创治疗方法，近年来迅速发展。这种治疗通过在表皮中创建穿孔并将无线电频率产生的热能传递到底层真皮来诱导新胶原的生成。同时，微针对皮肤的机械作用也改善了局部产品的经皮吸收，并促进生长因子的分泌，刺激相邻角质细胞和成纤维细胞的迁移和增殖，用于皮肤重塑。目前，射频微针治疗仪在皮肤重juvena-的治疗中也表现出良好的疗效，包括治疗青春痘、痤疮疤痕、手术疤痕、腋下多汗症、妊娠纹等。

在本研究中，我们旨在确定射频微针治疗仪的能量是否影响保妥适的疗效，并为临床上结合保妥适疗法的能量设备提供最佳策略。

2 | 材料与方法

2.1 | 受试者和治疗

参与者是通过回顾西南医院皮肤科的病历来选择的。共有45名女性（年龄从27岁到48岁，平均年龄为38.63 ± 4.62岁），患有中重度眼周鱼尾纹。他们根据不同的治疗方法和间隔被分成三组，包括保妥适组（仅保妥适注射）、射频微针治疗仪 + 保妥适（立即）组（射频微针治疗仪治疗后立即注射保妥适）、以及射频微针治疗仪 + 保妥适（7天间隔）组（射频微针治疗仪治疗后7天注射保妥适）。 

排除标准包括在研究前6个月内使用保妥适或在眼周鱼尾纹上进行任何表面再造手术、对注射物质过敏、怀孕的女性，以及具有瘢痕病史或异常愈合瘢痕的个体。陆军医科大学西南医院伦理委员会批准了这项研究。在收集数据之前，所有参与者提供了书面知情同意。 

2.2 | 小鼠

2.2.1 | 小鼠模型和分组

从陆军医科大学实验动物中心购买的特定病原体自由的雄性BALB/c小鼠，体重25 ± 1克。小鼠被置于精确控制的环境中，温度（22 ± 1°C）、湿度（55% ± 10%）和12小时的光暗循环。然后，一台小鼠竿疲劳测试仪（型号：XR-6C，上海新软信息技术，中国）对小鼠进行了1周的跑步训练，终点事件是小鼠以预设的最大速度稳定地完成整个跑步过程。提前一天，使用电动剃须刀和脱毛方案剃除了小鼠的双腿毛发。

脱毛后，BALB/c小鼠随机分成八组（每组n = 6），包括对照组、射频微针治疗仪组（仅射频微针治疗仪治疗）、保妥适组（仅保妥适注射）、射频微针治疗仪 + 保妥适（立即）组（射频微针治疗仪治疗后立即注射保妥适）、射频微针治疗仪 + 保妥适（24小时间隔）组（射频微针治疗仪治疗后24小时注射保妥适）、射频微针治疗仪 + 保妥适（2天间隔）组（射频微针治疗仪治疗后2天注射保妥适）、射频微针治疗仪 + 保妥适（3天间隔）组（射频微针治疗仪治疗后3天注射保妥适）和射频微针治疗仪 + 保妥适（7天间隔）组（射频微针治疗仪治疗后7天注射保妥适）。

2.2.2 | 干预

在充分暴露股四头肌肌肉后，我们使用了射频微针治疗仪系统（深圳半岛医疗有限公司旗下）。

射频微针治疗仪设备配备了一次性尖端，由49个微针电极排成行。治疗参数设置为：穿透深度0.5毫米，功率4瓦，持续时间200毫秒。然后，肉毒杆菌毒素A型（Botox，Allergan Inc.）的小瓶子在100单位瓶（40单位/毫升）中加入2.5毫升生理盐水重新制备。该毒素以每只小鼠1单位的剂量注射到右侧股四头肌肌肉，按照预设的时间间隔点。对照组接受等体积的生理盐水注射。右侧股四头肌肌肉的肌肉样本在两个时间点获得（每个时间点3只大鼠）：注射后7天和28天。

2.3 | 评估

2.3.1 | 患者疗效和满意度

治疗反应是使用Crow's Feet Grading Scale（CFGS）来测量的。7 CFGS是一种5分级的光数值评定尺度，旨在客观量化鱼尾纹的严重程度。该尺度用于对鱼尾纹的两次评估：静止状态（静态）和表情状态（动态）。该尺度的评分为0表示没有皱纹，1表示非常细微的皱纹，2表示细微的皱纹，3表示中度皱纹，4表示严重皱纹。本研究的主要目的是观察每个治疗组中动态皱纹的改善效果。每位受试者填写了自我评估问卷，并将其状况评分从0（加重）到4（显著改善）。

2.3.2 | 肌肉力量测定

为了量化保妥适引起的局部肌肉麻痹，使用了一个由水平杆、驱动电机和滑轮系统以及用于测量从梁上掉落的潜伏期的每个段下面的行程开关组成的调查系统。8 我们设置了两个旋转速度（15 rpm和20 rpm），并将小鼠放在慢速设置（5 rpm）的旋转梁上，以持续增加速度以训练平衡和奔跑能力，直到它们在15 rpm和20 rpm的速度下表现稳定并在原地停留3分钟。完成这个阶段后，小鼠在继续下一次训练之前休息了15分钟，这个过程重复三次。保妥适注射后的1、3、7、14、21和28天进行了跑步测试，系统将自动记录小鼠摔倒的时间和距离。

2.3.3 | 肌肉质量测定

在给予保妥适或射频微针治疗仪治疗后的28天，测量了每只小鼠的体重（BW）然后进行解剖并称量了注射的股四头肌肌肉。注射肌肉的萎缩程度通过右侧股四头肌肌肉重量与BW的比值来表示。选择第28天作为最终时间点，因为先前的研究证实这是保妥适引起的肌肉萎缩的最大点。

2.3.4 | 定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）

根据制造商的说明书，在Trizol试剂（Invitrogen）中裂解了小鼠肌肉样本。cDNA使用PrimeScript® RT试剂套件（TaKaRa，日本滋贺县）在10μL的体积中合成，产品使用SYBR® Premix Ex TapTM试剂套件（TaKaRa）检测。数据在M × 3000 P实时PCR系统（Stratagene）上进行收集和定量分析。相关基因的主要引物序列列于表1中。

（表1）

2.3.5 | 血液病理染色（HE染色）

在保妥适注射或射频微针治疗仪治疗后指示的时间，通过颈椎脱位将小鼠牺牲，以收集股四头肌肌肉进行组织学检查。它被固定在10%中性福尔马林中，并嵌入白色石蜡中。制备了4μm厚的连续石蜡切片，并用hematoxylin–eosin（H&E）染色。组织玻片转换成数字图像，并通过iViewer图像分析软件（UNIC Technologies）进行分析。

2.4 | 统计分析

结果以均值±标准差（SD）表示。所有统计分析均使用SPSS 23.0版（IBM）进行。符合正态分布的所有数据都经过双尾学生t检验或单因素方差分析进行检验。统计学显著性定义为p <0.05。

3 | 结果

3.1 | 不同治疗的患者满意度和疗效

治疗前和治疗后通过CFGS评估了眼周鱼尾纹的严重程度。如表2所示，在治疗前三组之间的基线值没有显著差异（p > 0.05）。治疗4周后，保妥适组的CFGS评分从3.33 ± 0.60下降到0.53 ± 0.50，射频微针治疗仪 + 保妥适（7天间隔）组的CFGS评分从3.47 ± 0.50下降到0.60 ± 0.49，治疗后这两组之间没有显著差异。但是，射频微针治疗仪 + 保妥适（立即）组的CFGS评分仅从3.40 ± 0.49下降到1.33 ± 0.47，显示眼周鱼尾纹改善效果不如其他两组（p < 0.05）。有趣的是，从表3中可以看出，在治疗后三组患者的满意度没有显著差异。如图1所示，保妥适组和射频微针治疗仪 + 保妥适（7天间隔）组的疗效是一致的，而射频微针治疗仪 + 保妥适（立即）组的效果较差。

（表2）

（表3）

（图1）

3.2 | 保妥适引起肌肉麻痹的效果

在向股四头肌注射了肉毒杆菌毒素A后，测量了潜伏期（小鼠在梁上停留的时间）。结果显示，与对照组相比，肉毒杆菌毒素注射后的潜伏期立即减少，并在治疗后3天达到最大下降。下降程度在C组（保妥适）、G组（射频微针治疗仪 + 保妥适，3天间隔）和H组（射频微针治疗仪 + 保妥适，7天间隔）之间更加明显，D组（射频微针治疗仪 + 保妥适，立即）、E组（射频微针治疗仪 + 保妥适，24小时间隔）和F组（射频微针治疗仪 + 保妥适，2天间隔）之间的差异也更显著（p < 0.05）。如图2所示，在15 rpm和20 rpm的速度之间，这些结果是一致的。随后，在1个月内，所有组的小鼠潜伏期逐渐恢复到基线水平。

（图2）

3.3 | 保妥适注射后诱导肌肉萎缩

除了保妥适对肌肉力量的影响外，我们进一步探讨了其对肌肉形态学的作用。如图3A所示，我们发现，在保妥适注射后的第28天，每个保妥适注射组的股四头肌质量与体重比明显降低（p < 0.05），与对照组相比。而射频微针治疗仪组与对照组之间没有显著差异。值得注意的是，保妥适组的比值与射频微针治疗仪 + 保妥适（立即）、射频微针治疗仪 + 保妥适（24小时间隔）和射频微针治疗仪 + 保妥适（2天间隔）组相比显著降低（p < 0.05），但保妥适组、射频微针治疗仪 + 保妥适（3天间隔）组和射频微针治疗仪 + 保妥适（7天间隔）组之间没有显著差异。

（图3）

因此，如图3B所示的股四头肌肌肉形态学结果证实了上述数据，即仅注射保妥适和射频微针治疗仪与保妥适结合，并在3和7天之间具有较长的间隔时，可以引起比其他组更明显的肌肉萎缩。注射保妥适治疗后3或7天的肌肉显示出与仅注射保妥适相似的萎缩。此外，HE染色证实了萎缩肌纤维核明显染色在保妥适、射频微针治疗仪 + 保妥适（3天间隔）和射频微针治疗仪 + 保妥适（7天间隔）组中。射频微针治疗仪 + 保妥适（3天间隔）组和射频微针治疗仪 + 保妥适（7天间隔）组之间没有明显差异（图3C）。

3.4 | MuRF1和Atrogin-1基因的实时定量PCR表达

如图4所示，与对照组相比，去神经化增加了MuRF1（图4A）和Atrogin-1（图4B）基因的表达（p < 0.05）。与保妥适组相比，当联合治疗之间的间隔小于2天时，MuRF1和Atrogin-1的mRNA积累明显减少（p < 0.05）。然而，当保妥适至少在射频微针治疗仪治疗后2天内给予时，MuRF1和Atrogin-1的表达水平与保妥适组相似（p > 0.05）。

3.5 | AchRα，MuSK，NCAM和MRF4基因的实时定量PCR表达

AchRα，MuSK，NCAM和MRF4表现出相同的模式，在所有去神经化组中与对照组相比均有上升趋势（图5）。与保妥适组相比，射频微针治疗仪 + 保妥适（立即）组和射频微针治疗仪 + 保妥适（24小时间隔）组的AchRα mRNA略微减少。然而，在超过2天的间隔后，每组中的AchRα表达也与保妥适组没有显著差异。MRF4的表达模式与AchRα相同。此外，MuSK和NCAM的表达水平在3天以上的间隔内与保妥适组没有显著差异。

（图5）

4 | 讨论

保妥适与各种能量设备的联合治疗对许多患者都更有益，因为它们可以针对面部的不同区域并相互补充。这一观点得到所有临床医生的认可，并在美容医学中得到广泛应用。我们的研究首次比较了保妥适注射独立治疗、保妥适注射后立即进行射频微针治疗仪治疗以及保妥适注射后间隔7天进行射频微针治疗仪治疗在改善眼周动态皱纹方面的临床疗效。我们发现每组患者都非常满意（p > 0.05）。令人惊讶的是，通过使用CFGS评分眼周鱼尾纹的临床医生发现，立即注射保妥适后进行射频微针治疗仪治疗也可以改善动态皱纹，但效果不如其他两种治疗方式（p < 0.05）。因此，我们推测在射频微针治疗仪治疗后的特定时间内注射保妥适会影响保妥适的疗效。

为了验证我们的假设，我们建立了一个梯度时间的小鼠模型组，包括立即注射、24小时间隔、2天间隔、3天间隔和7天间隔，并将它们与对照组和保妥适组进行比较。同时，为了排除射频微针治疗仪治疗对肌肉力量和神经肌肉功能可能的潜在影响，我们还建立了射频微针治疗仪组。结果显示，所有保妥适治疗组在体内引起了不同程度的肌肉麻痹，而保妥适组、射频微针治疗仪 + 保妥适（3天间隔）组和射频微针治疗仪 + 保妥适（7天间隔）组引起的麻痹效应高于其他治疗组。然而，对照组和射频微针治疗仪组没有引起肌肉麻痹和神经肌肉功能的改变。

众所周知，保妥适的化学去神经化通过泛素蛋白酶体机制引起肌肉萎缩。两种与肌肉萎缩密切相关的肌肉特异性泛素连接酶E3，肌肉萎缩F-box（Atrogin1）和肌肉环指1（MuRF1），在各种肌肉萎缩模型中均上调。通过检测这些肌肉萎缩指标的表达，我们发现保妥适组、射频微针治疗仪 + 保妥适（3天间隔）组和射频微针治疗仪 + 保妥适（7天间隔）组的表达水平较高，与其他组的肌肉力量和肌肉质量的结果一致。

以前的研究已经确认，注射保妥适后，NMJ会出现不稳定和去神经化。因此，我们测量了参与NMJ形成和稳定的关键因子的表达。在NMJ中，大量的尼古丁乙酰胆碱受体（nAChR）存在于 postsynaptic 肌膜的表面。我们发现，在NMJ的postsynaptic侧，大多数nAChR亚基mRNA在保妥适注射后上调，并在保妥适注射后2周恢复到正常水平。肌肉特异性受体酪氨酸激酶（MuSK）是一个关键蛋白质，协调nAChR NMJ的聚集和分化。肌肉调节因子4（MRF4）是肌肉调节因子的成员之一，与调节nAChR亚基表达密切相关。神经细胞粘附分子（NCAM）的主要作用是维持突触的稳定，从而影响神经传递。值得注意的是，NCAM存在于胚胎肌纤维束的表面，但随着发育的进行逐渐降解。但成年肌肉的去神经化会导致NCAM的重新出现。我们检测了上述四个因素的表达，并发现与保妥适组相比，随着治疗间隔的延长，它们的表达增加。当间隔超过3天时，它们的表达水平与保妥适组相似。这些证据表明，射频微针治疗仪疗法对保妥适的毒性作用具有一定的拮抗作用，而这种拮抗作用将在3天后消失。

肉毒神经毒素是一种分子量为150 kDa的多肽，其中一个100 kDa的重链通过热敏性二硫键和非共价力与一个50 kDa的轻链相连接。纯保妥适是一种白色结晶粉末，可溶于水。但它的稳定性较差，容易受热、机械力和氧气降解。尽管已知肉毒毒素在约37°C左右具有最佳的生物活性，并且在85°C左右热处理5分钟后失活，但关于组织中肉毒毒素的耐热性影响尚不清楚。

射频微针治疗仪的能量可以有选择性地瞄准真皮。为了实现真皮胶原蛋白的最佳变性和再生，射频微针治疗仪的尖端温度通常设置在55°C–65°C。射频微针治疗仪释放的脉冲能量迅速在真皮中形成热沉积区。与此同时，局部反应，包括红斑、水肿和灼烧感，通常在射频微针治疗仪治疗后持续2–3天，其中尤以局部水肿最为明显，这可能也会稀释毒素并增加表皮到靶肌肉的距离。局部炎症和热沉积似乎是降低保妥适疗效的主要原因。

结合保妥适和能量设备已被证明是安全的，比任何单一疗法更有效。然而，关于这种联合治疗对保妥适活性的影响几乎没有研究。对19名患者的回顾性研究发现，包括IPL、脉冲染料激光、二极管激光、单极性射频和Nd: YAG激光在内的几种设备与肉毒毒素同时使用既不降低治疗疗效，也不会削弱非靶肌肉的效果。在另一项对30名患者进行的前瞻性随机研究中，联合治疗取得了更大的总体改善。但在该研究中，没有患者在鱼尾纹方面获得完全的改善。这些差异可能与基于临床医生的实践和个人经验的主观评估方法有关。在我们的研究中，我们基于临床发现建立了小鼠模型，并进一步比较了在不同治疗条件下小鼠中由肉毒毒素引起的肌肉麻痹和NMJ不稳定性之间的差异。据我们所知，这是第一项研究，检查了能量设备是否会影响体内肉毒毒素的活性。

与此同时，我们的研究也存在一些局限性。首先，样本量略小。其次，射频微针治疗仪治疗对保妥适活性的影响的相关机制需要进一步探讨。但是，我们的研究通过体内实验评估了射频微针治疗仪治疗对保妥适活性的影响。未来，我们将进一步探讨相关机制，以实现临床医学的最佳疗效。

结论

总之，保妥适与各种能量设备的联合治疗在美容医学中得到广泛应用和推荐。在这项研究中，我们将射频微针治疗仪与保妥适结合应用于不同时间间隔的眼周皱纹治疗，这在一定程度上有益于临床实践。结果显示，射频微针治疗仪与肉毒毒素在短时间内的联合治疗会对保妥适的活性产生一定的降低效应，并且这种降低效应会持续3天。因此，我们建议在临床实践中，能量设备治疗和保妥适注射应至少间隔3天进行，以确保保妥适的最佳疗效。

reference：

Jiang L, Liang G, Li Y, et al. Doesmicroneedle fractional radiofrequency system inactivatebotulinum toxin type A? J Cosmet Dermatol. 2023;22:2008-2017. doi:10.1111/jocd.15826 

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